作者：谢媛，程兴群，徐欣，四川大学华西口腔医院；李雨庆，口腔疾病防治全国重点实验室国家口腔医学中心国家口腔疾病临床医学研究中心
粪肠球菌为低GC含量的厚壁革兰氏阳性球菌，是根管治疗失败后患牙根管中最常分离到的细菌，分离率达24%～77%，相对丰度占根管内细菌总量的1%～100%，是难治性根尖周炎的核心微生物。粪肠球菌在外环境胁迫条件下可进入一种存活但不可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态，后伺机复苏，进一步造成持续性感染。
粪肠球菌黏附于根管壁牙本质形成生物膜并侵袭牙本质小管是其导致牙齿根管系统及根尖周组织感染的关键，而胶原是粪肠球菌与牙本质特异性结合的靶点，所以粪肠球菌更易黏附于胶原含量更多的管间牙本质。体外实验表明，粪肠球菌在根尖区的定植往往少于根中和根冠区，且更易侵袭颊舌侧的牙本质小管。
此外，有研究发现，体外培养21 d后粪肠球菌侵入牙本质小管的深度可达到400µm，黏附深度可达200µm，其中黏附于1～100µm深度的粪肠球菌黏附性更高。除牙本质外，粪肠球菌对牙胶、根管封闭剂等牙科材料也有较好的亲和力，也是再治疗患牙感染牙胶内的优势菌株。在难治性根尖周炎患牙根管内分离的粪肠球菌中可检测到大量与细菌黏附相关的毒力因子表达，且其表达水平与临床症状密切相关，提示粪肠球菌黏附相关因子在根管感染中发挥重要作用，深入研究其介导细菌黏附的分子机制及影响因素，有利于对该菌引起的难治性根尖周炎的精准防治。本文就粪肠球菌对根管牙本质的黏附机制及其影响因素进行综述。
1. 粪肠球菌黏附相关毒力因子及双组份调控系统
粪肠球菌与黏附相关的毒力因子主要包括肠球菌胶原结合蛋白（adhesin of collagen from enterococci，Ace）、表面蛋白（extracellular surface protein，Esp）、心内膜炎和生物膜相关菌毛（endocarditis and biofilm associated pilus，Ebp）、聚集物质（aggregation substance，AS）、
1.1 肠球菌胶原结合蛋白
肠球菌胶原结合蛋白（Ace），又称黏附素，由粪肠球菌ace基因编码，属于MSCRAMM(microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules）家族，属肠球菌细胞壁锚定蛋白，可黏附于细胞外基质中的各种胶原蛋白（主要是Ⅰ型和Ⅳ型胶原）。Ace基因的缺失可显著降低粪肠球菌与牙本质的黏附性，Ace以“拥抱”的方式结合牙本质胶原，通过壳聚糖处理后的牙本质可以通过位阻效应及中断疏水作用来减少粪肠球菌Ace对牙本质胶原的黏附。
此外，ace基因与粪肠球菌对根管内消毒药物（
1.2 表面蛋白
表面蛋白（Esp）由粪肠球菌esp基因编码，与葡萄球菌表面蛋白Bap同源，其N端的DEv-Ig样结构域具有黏附功能，并能增强生物膜抵抗机械或降解破坏的能力，促进粪肠球菌在生物膜中的滞留，esp基因的存在是生物膜形成能力的重要标志，与抗菌药物耐药性相关。Francisco等研究发现，从难治性根尖周炎患牙中分离的粪肠球菌菌株esp基因检出率高达56%，提示其是该细菌导致根管感染的重要毒力因子。
1.3 明胶酶及丝氨酸蛋白酶
明胶酶（Gel E）是一种锌金属蛋白酶，由位于
除gel E基因外，位于其下游的丝氨酸蛋白酶基因spr E编码的丝氨酸蛋白酶（Spr E）与粪肠球菌的牙本质黏附性也有着重要关系，spr E缺陷株对牙本质的黏附性显著低于野生菌株，且该酶耐受碱性环境的特性提高了该酶在根管内的作用效力。不过目前，Gel E及Spr E增强粪肠球菌与牙本质黏附性的机制尚不明确。
1.4 菌毛
革兰氏阳性菌的菌毛在介导细菌定植和生物膜形成中起着重要作用。粪肠球菌心内膜炎和生物膜相关菌毛（Ebp）由ebp基因编码，含ebp A、ebp B和ebp C 3个基因，分别编码菌毛表面亚基、细胞壁锚定亚基和菌毛主体亚基，其定位独立于肽聚糖的发生，其中位点相对保守的Ebp A起到重要的黏附作用，具有抗原表型，可以作为疫苗开发的潜在靶点。
ebp基因突变株会导致菌毛产生减少以及对阴道上皮的初始黏附降低，菌毛还与心内膜炎、
1.5 聚集物质
粪肠球菌受体菌可分泌性信息素，诱导含有共轭质粒的供体菌表面形成聚集物质（AS），进而产生黏附和聚集，其由质粒编码，包括p AD1编码的Asa1，p PD1编码的Asp1，p AM373编码的Asm373，以及研究较多的p CF10编码的Asc10等。p CF10上含有prg Q操纵子及下游的prg A、prg B（编码聚集物质）和prg C基因，Prg B N端含有黏附素结构域，而Prg A则为细胞黏附提供了物理屏障，减少了细胞聚集。AS可以结合细胞外基质蛋白，促进细菌聚集物及生物膜的形成，增加对宿主组织的附着。不过同菌毛一样，其在介导粪肠球菌根管内定植和感染中的作用尚未见报道。
1.6 其他黏附相关毒力因子
与链球菌口腔相关黏附素高同源性的心内膜相关抗原（endocardial fibroelastosis-associated antigen A，efa A）在牙髓治疗失败患牙根管内检出率高，以efa A基因为靶点的肽核酸可以显著抑制粪肠球菌生物膜的形成，被认为是粪肠球菌黏附及生物膜相关毒力因子之一。Korir等发现粪肠球菌epa Q基因突变株表面疏水性增加，生物膜形成过程中初始黏附降低，该基因在粪肠球菌初始黏附中可能发挥了重要的作用。Ladjouzi等构建了多核苷酸磷酸化酶PNPase的突变粪肠球菌菌株，并与野生株进行转录组学分析，在生长3 h和6 h后，发现众多参与细胞壁合成、黏附、生物膜形成的基因差异性表达，提示其参与了粪肠球菌的黏附过程。
1.7 粪肠球菌双组份调控系统
粪肠球菌双组份系统（TCS）是响应外环境调控转录的重要信号通路，通常由识别特定环境信号的传感器
粪肠球菌fsr(E.faecalis sensor regulator）双组份系统为群体感应系统，能通过细胞密度来调节群体行为，起到环境监测作用，其编码基因位于gel E（明胶酶）和spr E（丝氨酸蛋白酶）基因上游，编码Fsr C感觉激酶、Fsr A反应调节因子、Fsr B及Fsr D衍生的自身诱导物，可调节下游Gel E和Srp E的表达，进一步调节粪肠球菌的初始黏附。
在转录后水平，Gel E可以裂解菌体表面的Ace蛋白，fsr双组份系统通过影响细菌gel E的表达，减少菌体表面Ace的量，进而降低粪肠球菌的黏附。Fsr双组份系统不仅是Gel E和Srp E的激活剂，对其他生物膜相关因子以及生物膜基质如e DNA及胞外多糖等也起到了重要的调节作用。此外，双组份系统Lux S也属于群体感应系统，可调节粪肠球菌生物膜形成和细菌的表面疏水性，该系统在fsr双组份系统缺乏的粪肠球菌中起到了重要作用。
Grv RS双组份系统也参与调控了不同应激条件下ace的表达，grv R突变株ace表达显著下调，而该双组份系统在响应血清环境时，ace表达上调。有研究表明，粪肠球菌黏附力的增加以及抗生素的存在可以激活Cro RS双组份系统，并可能通过增加黏附与生物膜形成相关基因gel E、ebp A及ace的表达，进而增加其抗菌性。此外，Wal RK双组份系统作为粪肠球菌唯一必须的双组份系统，在碱性胁迫条件下，Wal RK双组份系统下调，ace、gel E、esp基因表达也下调，提示该系统也可能参与碱性胁迫条件下黏附相关因子的调节。
上述相关毒力因子介导了粪肠球菌对牙本质的黏附，从而进一步发挥致病作用，这些毒力因子还能够进行水平基因转移，实现种内和种间的传播，增加了防治其感染的难度。
2. 影响粪肠球菌与牙本质黏附的因素
2.1 根管机械/化学预备
粪肠球菌可黏附于牙本质内壁，而根管机械预备可以改变根管内壁微观形态，从而进一步影响粪肠球菌的黏附。Xu等研究发现根管机械预备后的牙本质表面粗糙度更小，表面接触角更大，表面附着菌量反而更多，基于此研究，作者认为临床上应加大化学预备来降低残留菌的致病性。
化学预备能够改变根管内壁粗糙度、润湿性及表面成分，进一步改变粪肠球菌对牙本质的黏附。金属离子螯合剂EDTA和次氯酸钠能够分别暴露和溶解胶原纤维，从而分别增加和降低粪肠球菌对牙本质的黏附，
目前，次氯酸钠配伍EDTA作为最为经典的冲洗方案被广泛使用，但是此种配伍可能造成牙本质微观结构改变，如牙本质侵蚀及粗糙度变化，有研究发现“原花青素（proanthocyanidin，PA）+羧甲基壳聚糖/无定形磷酸钙（carboxymethyl chitosan/amorphous calcium phosphate，CMC/ACP）纳米配合物”在保证良好的根管内消毒作用外，还可以维持牙本质有机-无机结构完整性。而目前研究较多的“连续螯合冲洗策略”，即次氯酸钠与较为温和的螯合物如
此外，Titato等研究发现EDTA与
此外，经合适功能的半导体激光照射后，粪肠球菌参与黏附及生物膜形成的基因gel E、ace、esp显著下调，并抑制了细胞外多糖的合成，从而降低了粪肠球菌与牙本质的黏附性。抗菌光动力疗法有较强的杀灭粪肠球菌的作用，包括根管内分离的临床株，但是却显著上调了残留浮游菌黏附相关毒力因子表达，包括群体感应系统fsr及其下游黏附相关毒力因子gel E，但是当光动力疗法作用于粪肠球菌体外生物膜后，与黏附相关的毒力因子efa A、esp、gel E和fsr表达水平却显著降低。
2.2 根管内环境
Ran等发现粪肠球菌在碱性及饥饿环境下对牙本质小管的侵袭能力显著降低，与黏附相关的基因ace、esp、gel E、frs B显著下调，但在部分碱性及饥饿条件下可能首先表现出黏附性增加，然后再降低。学者研究发现，持续性根尖周炎患牙中分离的粪肠球菌菌株在
3. 粪肠球菌黏附于牙本质的预防及处理方法
研究发现，根管治疗失败患牙内粪肠球菌与患者唾液内粪肠球菌存在遗传相关性，提示根管内感染的来源可能是唾液中粪肠球菌，建议使用橡皮障隔离来避免引入粪肠球菌。此外，干扰粪肠球菌牙本质黏附的相关冲洗液也可以预防根管内粪肠球菌的二次黏附，如前文所述EDTA与苯扎氯铵配伍、抗菌肽GH12等，而使用石墨烯等材料对牙本质表面进行改性后，粪肠球菌也较难进行二次黏附。
由于根管系统的复杂性，附着在根管峡部、侧支根管以及根尖分歧等结构中的粪肠球菌往往难以彻底清除，粪肠球菌还能够定植于牙本质小管内部，有研究发现，再治疗患牙在经过常规根管预备和封药后根管内仍能够检出粪肠球菌，所以常规的机械化学预备很难实现根管内感染的彻底清除。而辅助根管荡洗方法可以通过活化冲洗液、增加冲洗液流速等方式进一步清除牢牢黏附于牙本质的生物膜。
研究表明，超声活化荡洗可以增加冲洗液的作用深度，进而实现粪肠球菌的“深度清洁”。而相比于单纯使用次氯酸钠溶液冲洗，配合使用声波激活或者光动力作用的次氯酸钠溶液也能更有效地减少根管内细菌负荷。临床新型的激光活化荡洗技术也可以通过空泡内爆和冲击波产生高速流体运动来增加冲洗液与牙本质内壁的剪切力，进而增加根管内细菌的清除率。然而，目前尚没有一种冲洗方法能够将构建的离体牙粪肠球菌感染模型内的粪肠球菌完全去除，体现出粪肠球菌在根管内黏附的持久性，所以，需要研究新的冲洗液及活化荡洗方法来进一步控制根管内粪肠球菌的黏附和感染。
4. 总结及展望
综上所述，粪肠球菌与黏附相关的毒力因子在介导其与牙本质黏附和根管感染中发挥了重要作用，针对上述因子开发合理药物或者疫苗对根管感染控制有重要意义。尽管目前已发现众多与粪肠球菌黏附相关的毒力因子，但各因子在介导细菌牙本质黏附中的作用与具体机制尚不清楚，常见根管化学预备手段对粪肠球菌黏附相关毒力因子影响的分子机制也有待进一步研究。
而根管的宏观形态、常见根管消毒药物及根充糊剂等对粪肠球菌黏附性的影响相关研究也可以为临床决策提供重要的参考意义，也期待开发更多有效的药物和临床新技术来预防和处理根管内粪肠球菌的黏附。此外，从根管治疗失败患牙根管及根尖周病损组织中分离、鉴定、保藏粪肠球菌临床菌株，建立该菌临床菌株生物样本库，借助泛基因组学与转录组、代谢组等多组学联合研究，深入解析粪肠球菌牙本质黏附与致病的分子机制，有望为难治性根尖周炎的临床防治提供新的思路与途径。
来源：谢媛,程兴群,李雨庆,等.粪肠球菌牙本质黏附及其影响因素的研究进展[J].口腔疾病防治,2024,32(08):632-639.
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