作者：章锦曼，朱宝生，昆明理工大学环境工程学院 ，云南省出生缺陷与罕见病临床医学研究中心

导致人类疾病的遗传变异复杂多样，包括染色体数目异常、致病性拷贝数变异（pathogeniccopynumber variations，P-CNV）、单基因突变、多基因突变、基因表达异常等等，某些遗传变异可导致致命或者严重致残的健康损害，患儿预后不良。产前确诊可及时终止妊娠，避免患儿出生［1］。传统的染色体核型分析作为产前诊断染色体畸变的金标准已使用多年，但存在耗时、耗力、分辨率低、依赖于细胞培养技术、不能发现小于5~10Mb的遗传变异等不足。近年来，基因芯片、高通量测序及其他基因检测技术的不断成熟和临床应用，拓展了侵入性产前诊断的适宜病种。

基于基因芯片技术的染色体微阵列分析（CMA）可以检测染色体数目异常、拷贝数变异（CNV）、单亲源二体。有学者提出在人力资源不足的产前诊断实验室可仅使用CMA替代染色体核型分析［2-3］；但CMA因探针密度受限，可能漏检部分P-CNV、不能检测低比例嵌合体（＜30%）等，需要有其他补充检测技术［4］。基于二代测序（NGS）技术的高通量检测方法可以在基因组水平上进行拷贝数变异测序（CNV-seq）、基因包（gene panel）测序、全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）以及互联网背景下的全球化资料和信息共享，共同促进了侵入性产前诊断近年的快速发展。

1 产前诊断中常用的高通量测序技术

1.1   拷贝数变异测序   专家认为，CNV-seq技术可在产前诊断中作为细胞遗传学检测技术的补充［5-6］。与CMA相比，CNV-seq属于非订制化技术，在基因组绝大多数区域内都可以无差别地检测出CNV，其分辨率可按测序深度不同而适应临床需求［7］。笔者所在产前诊断中心采取平行检测胎儿核型及CNV-seq方法，发现致病性染色体微缺失/微重复病例约占所有产前诊断病例的1.2%。常染色体P-CNV的胎儿更容易在中孕期或晚孕期发现存在结构畸形或生长受限等，而性染色体P-CNV的胎儿超声检查多无异常，如Xp22.31、Xp21.1、Xq22.1-q22.2的微缺失/微重复等。联合核型分析和CNV-seq的产前诊断方案有利于相互验证，避免漏诊。由于所用的测序深度低，CNV-seq的不足在于：不能检测胎儿染色体多倍体、染色体平衡性结构异常、低比例的染色体嵌合体、杂合性丢失等。

因缺乏在中国健康人群中的CNV数据，临床实践中对CNV的判读和解释能力尚有欠缺［8］。目前主要应用2015年美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）、分子病理协会（AMP）和美国病理学家协会（CAP）共同制定并于2019年更新的指南，将CNV-seq结果分为5类：致病性（pathogenic，P）、可能致病性（likely pathogenic，LP）、临床意义不明确（uncertain significance，VUS）、可能良性（likely benign，LB）和良性（benign，B）［9-10］。不同类别CNV的预后不同，并不是所有的P-CNV胎儿均预后不良，如Xp22.31微缺失属于P-CNV，但绝大部分受累男胎出生后为单纯鱼鳞病，预后较好。胎儿存在VUS-CNV时，建议夫妻行CNV-seq，判断胎儿VUS的来源，结合片段大小、片段重复或缺失、家族史、胎儿超声检查等资料评估胎儿预后。部分胎儿CNV相关表型存在外显不全或表现度差异，即使确定了夫妻的CNV，仍无法准确预测胎儿出生后的表型。

1.2   高通量测序基因包   基因包检测（gene panel test）通过捕获多个特定基因全序列来进行高通量测序，适用于一些遗传异质性较高的遗传病，避免了一代测序（即Sanger测序）检测范围窄、多位点逐一检测成本高、耗时长的缺点，检测效率得到了提高。高通量测序基因包可以准确高效地从数十甚至上百个基因的DNA全序列测序中检测出累及某些器官系统疾病可能涉及的基因突变，并能够分辨出基因突变的纯合状态、杂合状态和嵌合体，但不能检测出基因包内未涵盖的其他致病基因是否存在突变。因此，随着对疾病认识的发展，基因包的设计也需不断补充更新，但更新速度一般落后于新致病基因被发现的速度，使得基因包存在一定的滞后性。1.3   家系全外显子组测序   WES可高效、无偏倚地对受检者基因组功能基因编码序列的遗传变异进行检测，不但测序面广，还可能检出未知的致病基因。2020年1月，ACMG发布了胎儿外显子组测序在产前诊断中的应用指南，建议对核型和CNV检测结果正常的超声异常胎儿，可以提供（一个家庭）3人组全外显子组测序（Trio-WES）。研究表明，不同胎儿超声异常的产前外显子组测序阳性率是显著不同的，如胎儿骨骼发育异常、中枢神经系统异常、肾脏异常及淋巴水肿病例的WES阳性率最高，而唇腭裂、心脏畸形的诊断阳性率相对较低。胎儿发育是一个动态和程序进展的过程，产前胎儿表型信息收集困难、表型术语使用不规范等都可能影响WES报告的准确性，更多地需要依靠生物信息学分析对所发现的结构基因异常进行蛋白质功能预测。通常Trio-WES的结果不能直接用于产前诊断，必须经过Sanger测序验证；其次是WES不能解决某些特殊的单基因病基因突变的检测，包括基因的倒位突变，如血友病A基因有长片段倒位存在。若高度怀疑是某种特殊类型的遗传病，或者WES未发现阳性结果，应考虑选择某种疾病的基因包或可能致病的单个基因测序。致病基因存在同源性较高的基因或假基因的单基因病（如脊肌萎缩症、先天性肾上腺皮质增生症）以及由短串联重复序列（STR）三联密码子异常重复引起的单基因病（如脊髓小脑共济失调、强直性肌营养不良、亨廷顿舞蹈症）不适合产前基因位点Sanger测序验证，需要其他方法检测。       WES也可用于单亲源二体（uniparental disomy，UPD）的产前诊断［11］。UPD是指1个个体的2条同源染色体或2条同源染色体的相同区带都来自于同一亲体，包括单亲源同二体（isodisomy，来自同一亲体的同一个染色体复制）和单亲源异二体（heterodisomy，分别来自同一亲体的两条同源染色体）。UPD是导致非缺失型的Prader-Willi综合征和天使综合征（Angelman syndrome）等基因组印记障碍和隐性纯合致病的一种遗传学机制。据估计，活产儿中所有染色体的UPD发生率为1∶3500。大多数染色体的UPD没有临床症状，但6、7、11、14、15、20号染色体的UPD可以通过基因组印记障碍导致临床症状。CNV-seq不能检测UPD疾病，对UPD疾病的高风险人群应安排相应产前检测。ACMG指南推荐需要产前UPD检测的情况包括：胎儿标记染色体、染色体罗伯逊易位以及6、7、11、14、15、20号染色体三体/单体嵌合体或相互易位、胎儿超声异常可能与某种UPD疾病表型相关，如脐膨出、羊水多、胎儿偏大、胎儿生长受限等。检测方法包括Trio-WES、MS-MLPA等。1.4   全基因组测序   WGS覆盖了全外显子组测序和芯片的优势，能检测染色体数目异常、拷贝数变异、平衡重排、UPD等，是最全面、最精准的检测方法，但目前因为其测序量大、数据分析困难，所需时间长，成本高昂，限制了其在产前诊断中的临床应用。若选择使用WGS进行产前诊断，则可能存在对于晚发病和非致死性、非致残疾病基因突变的发现可能导致“不完美胎儿”被人为选择性流产，以及无法准确预测外显不全遗传病的真实发育后果等等，造成伦理和医疗安全的问题。对于产前发现胎儿结构畸形或发育异常，常规手段无法确诊的时候，高通量测序可作为补充检测。

2 高通量测序技术在产前诊断中的应用现状

遗传性疾病的产前诊断需要结合胎儿表型与核型/基因型评估预后。胎儿表型获得的途径包括无创性检查（如孕妇主观感觉胎动、胎儿超声观察结构是否异常）和有创性检查（如胎儿镜观察胎儿皮肤毛发等，或采集羊水、脐带血标本进行常规或生化检测）。胎儿染色体核型/基因型则需要采集胎儿样本进行各种遗传学检测。

2.1   先证者病因明确的产前诊断   先证者病因明确，为常染色体隐性遗传病，再次妊娠产前诊断包括胎儿基因突变位点验证+产前连锁分析；X连锁隐性遗传病患者再次妊娠时，男性胎儿有50%的患病风险，再次妊娠产前诊断包括胎儿致病基因位点验证+产前连锁分析+性别决定基因检测；常染色体显性遗传病，新发变异时，再发风险低，但有生殖腺嵌合体风险，应酌情选择胎儿致病基因位点测序验证；先证者诊断明确，已夭折，无DNA样本，夫妻再次妊娠的产前诊断方案需要家系成员及胎儿致病基因位点验证；对线粒体疾病，因产前诊断结果对评估胎儿预后价值有限，可否提供产前诊断尚有争议。2.2   先证者病因不明确的产前诊断   先证者病因不明确，再次妊娠时，要求产前诊断的家庭因时间紧迫，产前诊断方案需要根据实际情况个体化确定。早孕期首次就诊，先对先证者及其家系成员进行病因学检测，再确定产前诊断方案。若首次就诊已处于孕中、晚期，充分告知后，紧急行先证者的病因学检测，根据家庭意愿决定产前诊断方案；先证者临床诊断明确，但基因检测为VUS时（新发或源自夫妻），近似于先证者病因不足够明确，产前诊断较为困难，扩大家系调查可有助于综合评估基因变异致病性，产前诊断酌情选择家系成员、胎儿基因位点测序验证+产前连锁分析，结合胎儿超声表型，综合评估预后。2.3   先证者已夭折且病因不明确的产前诊断    有过严重遗传病患儿的家庭，先证者已夭折，先证者病历和DNA样本缺失，无遗传学检测结果，或曾有胎儿畸形，未行遗传学检测或遗传学检测仅限于染色体核型分析，则再次妊娠的产前诊断充满风险和挑战。需要详细询问病史，收集信息，如先证者性别、发病年龄、症状体征、既往已行的检查、保存的图片等，为先证者的临床诊断提供线索。酌情对夫妻提供遗传病携带者筛查，或采用疑似疾病的高通量测序基因检测。根据检测结果决定是否提供后续的产前诊断。2.4   无先证者的产前诊断   孕前携带者筛查提示夫妻为遗传病基因突变携带者，或曾有流产组织检测提示明确致病性的基因突变，夫妻无遗传病患儿生育史，再次妊娠产前诊断需要扩大家系调查，评估已有遗传学检测结果的可靠性，酌情给予家系成员及胎儿致病性基因位点测序验证。孕妇首次妊娠后胎儿超声无异常，但整个孕期几乎都不能感觉到胎动，或者无胎儿翻滚等大动作，这种情况下，胎儿存在严重神经肌肉系统疾病风险大。但产前诊断也存在高不确定性，胎儿表型不能获得更多信息，可酌情选择夫妻临床WES，或严重神经肌肉系统疾病的携带者筛查，也期待更多的胎儿影像学检查方法以帮助评估胎儿预后。

3    结语

产前诊断对实验室检测的时效性要求非常高，若从胎儿核型、CNV-seq到基因包测序或者WES逐一行进阶式检测，可能无法在有效时间内获得产前诊断结果，但几种方法同时检测又会增加孕妇的经济负担。因此，需要医生掌握各种方法的检测范围，有的放矢，结合孕妇家庭的愿望，与患者讨论产前诊断风险与获益的关系，共同制定个性化的产前诊断方案。随着对遗传和生命信息认识的加深以及高通量测序技术成本的不断下降，期待不久的将来，会发展到不需要父母或先证者参与的胎儿WGS，甚至包括转录组、甲基化组学分析，可以预测胎儿生长受限、孕妇子痫前期风险和复发性早产风险等。 

参考文献 略.

来源：章锦曼，朱宝生， 高通量测序技术在产前诊断中的应用[J],中国实用妇科与产科杂志，2020，36（9）.