来源：IBD Daily

炎症性肠病 (IBD) 全球发病率持续上升，其肠道慢性炎症机制尚不明确。粪便钙卫蛋白 (CP) 是临床常用的IBD生物标志物，由S100A8和S100A9形成的异源四聚体构成，浓度 > 150 μg/g提示疾病活动。然而，CP在肠道中的生物学功能存在争议。临床中部分IBD患者有活动症状但粪便CP浓度 ≤ 150 μg/g，现有CP检测方法存在诊断缺口。已有研究表明，S100A8和S100A9的不同蛋白构型 (如二聚体与四聚体) 可能发挥截然不同的作用，同源二聚体具有促炎特性，而异源四聚体 (CP) 则不然。但IBD患者肠道中这些蛋白构型的存在情况及其功能尚不清楚。本研究旨在解析IBD患者粪便中S100A8/S100A9的蛋白构型及其生物学功能，探索其与疾病活动度和炎症慢性化的关联，并阐明其对肠道上皮和T细胞的炎症调控作用。

研究共纳入多个独立IBD队列。首先利用德国IBDome队列 (包含360份IBD组织样本与54份对照) 通过批量RNA测序 (Bulk RNA-seq) 分析肠道黏膜S100A8/S100A9表达与临床、内镜及组织学疾病活动度的相关性 (组间比较采用Wilcoxon检验)。克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC) 分别采用HBI (Harvey-Bradshaw Index) 和PMS (Partial Mayo Score) 评估临床活动度；分别采用SES-CD和UCEIS评估内镜活动度；分别采用Nani Corina评分和Riley评分评估组织学疾病活动度。然后对来自奥地利 (223例)、荷兰 (316例) 及德国 (84份结肠抽吸物) 的IBD患者粪便样本进行检测。采用尺寸排阻色谱联合LC-MS/MS技术分离并鉴定粪便中S100A8/S100A9的不同蛋白构型 (二聚体 vs. 四聚体)，同时使用特异性ELISA定量S100A8和S100A9二聚体浓度，结合逻辑回归分析二聚体的检出与否与疾病活性的关联。通过免疫共沉淀结合LC-MS/MS绘制了活动期IBD患者粪便中S100A8/S100A9的蛋白互作网络。

动物实验使用多种转基因小鼠 (S100a9^−/−、Gpx4^+/−IEC、Xbp1^−/−IEC、Il10^−/−、Rag1^−/−) 及双突变小鼠模型。通过口服灌胃给予人重组S100A8、S100A9同源二聚体或S100A8/S100A9异源四聚体，在多个肠炎/结肠炎模型中评估其效应，包括DSS诱导的急性结肠炎、Il10^−/−自发性慢性结肠炎、Gpx4^+/−IEC和Xbp1^−/−IEC小鼠的CD样肠炎 (分别通过富含多不饱和脂肪酸的西方饮食或普通饮食诱导)。同时，通过遗传敲除S100a9或使用S100A9特异性抑制剂Paquinimod (帕奎莫德) 进行药理学干预，观察对肠炎的保护作用。通过组织学评分、免疫组化等方法评估炎症严重程度及T细胞浸润。多组间比较采用ANOVA或Kruskal‑Wallis检验，两组比较采用t检验或Mann‑Whitney U检验。

研究构建人结肠上皮类器官单层，经S100A8/S100A9二聚体刺激后进行单细胞RNA测序，分析上皮细胞亚群的细胞因子反应和信号通路活性。从健康人外周血分离CD4⁺和CD8⁺ T细胞，体外给予同源二聚体或CP刺激，通过流式细胞术检测活化标志物 (CD25、CD69)、效应分子 (Granzyme B) 及细胞因子 (IL-17A)，并通过批量RNA测序和免疫印迹检测NF-κB、STAT3等信号通路。组间比较采用ANOVA或Kruskal‑Wallis检验。此外，利用Rag1^−/−小鼠 (缺乏适应性免疫) 验证S100A8/A9二聚体的促炎作用是否依赖于T细胞。

➤活动期IBD患者粪便中存在S100A8/S100A9二聚体，且其黏膜表达与疾病活动度密切相关

通过对IBD患者肠道黏膜进行转录组分析，研究发现炎症肠黏膜中S100A8和S100A9的表达水平显著高于非炎症肠黏膜组织及健康对照 (图1A)；两者的黏膜表达量与CD和UC患者的组织学疾病活动度均呈显著正相关 (图1B、1C)，且S100A8和S100A9在IBD患者黏膜中表达高度协同 (图1D)。随后，以人重组蛋白为参照，尺寸排阻色谱明确S100A8与S100A9等比例混合主要形成CP异源四聚体，同时存在少量二聚体 (图1E)，而S100A8或S100A9单独则形成同源二聚体 (图1F)，为粪便样本的构型判定提供了标准。实验流程如图1G所示。进一步对活动期CD和UC患者 (粪便CP > 500 μg/g) 的粪便进行尺寸排阻色谱分离，在分子量对应于二聚体的色谱组分中 (图1H、1I)，通过LC-MS/MS清晰检测到S100A8和S100A9 (图1J)，且二聚体浓度与同一来源样本中的CP相当 (图1K)。结肠镜灌洗液样本同样证实了二聚体的存在 (图1L、1M、1N、1O)。而健康对照的粪便中未见二聚体信号 (图1J)。综上，活动期IBD患者粪便和肠腔中除CP四聚体外还存在大量S100A8/S100A9二聚体，且其黏膜表达水平与疾病严重程度紧密相关，为后续探索二聚体的生物学功能与临床价值奠定了关键基础。

图1. IBD患者粪便中S100A8和S100A9二聚体的检测。

➤S100A9二聚体检出与低CP水平IBD患者的临床和内镜疾病活动度相关，现有临床CP检测存在诊断缺口

四种临床常规粪便CP检测试剂盒均能识别重组S100A8/S100A9异源四聚体，但无法检测S100A8或S100A9同源二聚体 (图2A)；相比之下，研究专用的ELISA可特异性检测S100A8或S100A9二聚体，且不识别CP (图2B、2C)，证实现有临床检测存在诊断缺口。研究流程如图2D所示。随后，对来自奥地利和荷兰两个独立IBD队列共539例患者进行检测，发现粪便S100A8二聚体检出率为46%，S100A9为15%，且两者的检出率与粪便CP浓度是否超过150 μg/g无明确关联 (图2E、2F)；健康对照中几乎无S100A9检出，仅少数有微量S100A8。进一步对粪便CP ≤ 150 μg/g的356例IBD患者进行分析，逻辑回归分析显示，S100A9二聚体的检出与临床疾病活动度显著相关 (未校正OR=2.14，P=0.022)，校正年龄、性别及疾病类型后关联仍稳健 (OR=2.27，P=0.015)，而S100A8检出无此关联 (图2G)。最后在德国队列的84例IBD患者中验证，低CP浓度 (≤ 150 μg/mL) 患者的结肠灌洗液中，S100A9浓度与临床、内镜疾病活动性均呈正相关 (图2H、2I)。临床CP检测无法识别具有潜在诊断价值的S100A8/A9二聚体，粪便S100A9二聚体检出可作为低CP浓度IBD患者判断临床和内镜活动度的补充标志物。

图2. S100A8和S100A9的定量及其与IBD疾病活动度的关系。

➤人S100A8/S100A9同源二聚体可加重小鼠肠道炎症，敲除S100a9可缓解小鼠肠道炎症

研究通过多种小鼠肠炎模型系统评估了S100A8/A9二聚体的体内促炎功能 (图3A)。首先在DSS诱导的急性结肠炎野生型小鼠中连续4天灌胃人重组S100A8或S100A9同源二聚体，结果发现小鼠体重显著下降 (图3B)、结肠组织学损伤评分明显升高 (图3C、3D)，同时结肠黏膜中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的浸润数量显著增加 (图3E、3F)；而灌胃CP异源四聚体的小鼠则未出现上述效应，表明二聚体的促炎作用具有构型特异性。在S100a9敲除小鼠中同样观察到，人S100A8或S100A9二聚体仍可加重DSS结肠炎，排除了人鼠蛋白嵌合效应的干扰。在Il10^−/−慢性自发性结肠炎模型中，连续7天灌胃S100A8或S100A9二聚体同样显著加重了结肠炎的组织学损伤 (图3G、3H)。此外，在西方饮食诱导的CD样肠炎模型 (Gpx4^+/−IEC和Xbp1^−/−IEC小鼠) 中，灌胃S100A8或S100A9二聚体也进一步恶化了肠黏膜炎症。反之，在DSS结肠炎模型中，S100a9^−/−小鼠的体重下降程度减轻、结肠组织学评分显著低于野生型及杂合子对照 (图3I-K)。在西方饮食诱导的CD样肠炎模型中，S100a9^−/−与Gpx4^+/−IEC双突变小鼠的肠炎评分较单突变对照明显降低 (图3L)；在Xbp1^−/−IEC自发性肠炎模型中，S100a9^−/−与Xbp1^−/−IEC双突变小鼠的肠炎评分同样显著改善 (图3M)。研究证实，S100A8和S100A9同源二聚体是肠道炎症的驱动因子，而S100a9是介导肠炎发生发展的关键基因。

图3. 人S100A8和S100A9同源二聚体促进小鼠肠道炎症。

➤人S100A8/A9同源二聚体可诱导人结肠上皮炎症反应并激活特异性促炎信号通路

研究首先通过免疫共沉淀结合LC-MS/MS构建了IBD患者粪便中S100A8/A9的蛋白互作网络 (图4A)，不仅证实S100A8与S100A9之间存在相互作用 (图4B、4C)，还发现二者与多种肠上皮相关蛋白 (如Galectin-4、MMP15) 存在互作，提示二聚体可能直接靶向并调控肠上皮细胞功能。随后，利用人结肠上皮类器官进行单细胞RNA测序 (图4D)，发现经S100A8或S100A9同源二聚体刺激后，多种结肠上皮细胞亚型 (特别是杯状细胞和结肠细胞) 中炎症相关细胞因子的表达被广泛诱导，例如杯状细胞中趋化因子配体CCL20显著上调 (图4E)。进一步通路活性分析发现，S100A8二聚体主要激活结肠上皮细胞中的TNF和NF-κB信号通路，而S100A9二聚体则诱导缺氧信号通路活化 (图4F)。研究从蛋白互作网络和单细胞转录组层面首次揭示了人S100A8/A9同源二聚体可直接作用于人结肠上皮，通过激活不同的促炎信号通路广泛诱导上皮细胞炎症因子表达，从而促进肠道炎症发生发展。

图4. 人S100A8和S100A9同源二聚体诱导上皮细胞因子反应。

➤人S100A8/A9同源二聚体可增强人CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化，激活NF-κB及JAK/STAT信号通路并诱导促炎细胞因子分泌

为明确二聚体对适应性免疫的直接影响，研究从健康人外周血分离CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行体外刺激实验 (图5A)。流式细胞术检测显示，S100A8或S100A9同源二聚体可显著促进CD4⁺T、CD8⁺ T细胞的活化，表现为活化标志物CD25、CD69的表达显著上调，同时效应记忆T细胞 (CD45RO⁺) 比例增加 (图5B-G)，而CP无上述效应，表明二聚体的促活化作用具有构型特异性。此外，S100A9二聚体可增加CD8⁺ T细胞中颗粒酶B的表达 (图5H)，且S100A8和S100A9二聚体均能诱导CD3⁺ T细胞分泌IL-17A，但不影响IFN-γ或TNF-α的产生 (图5I)。通过对CD8⁺ T细胞的转录组和蛋白水平验证，研究发现S100A8/A9二聚体可激活NF-κB和JAK/STAT信号通路 (图5J-L)，这两个通路是T细胞活化和炎症反应的核心通路。最后，通过抗原反应性T细胞富集实验，检测到针对S100A9二聚体的抗原特异性记忆CD4⁺ T细胞。综上，人S100A8和S100A9同源二聚体可直接增强人CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化与促炎功能，且S100A9本身可作为T细胞识别的抗原靶点。

图5. 人S100A8和S100A9同源二聚体增强T细胞活化。

➤S100A8/A9同源二聚体的促结肠炎作用依赖于适应性免疫，药物抑制S100A9可有效缓解小鼠急性和慢性结肠炎

为明确S100A8/A9二聚体促炎作用的免疫依赖性及靶向治疗潜力，研究首先利用缺乏适应性免疫的Rag1^−/−小鼠构建DSS结肠炎模型，并灌胃人重组S100A8或S100A9同源二聚体。结果发现，与溶剂对照组相比，二聚体处理组小鼠的体重下降曲线 (图6A)、结肠组织学损伤评分 (图6B) 及组织切片 (图6C) 均无显著差异，证明二聚体的致结肠炎作用依赖于适应性免疫。随后，使用S100A9特异性小分子抑制剂Paquinimod进行药理学干预。在DSS诱导的急性结肠炎野生型小鼠中，连续7天口服Paquinimod可显著降低结肠组织学评分、减轻黏膜炎症损伤 (图6D、6E)。在Il10^−/−慢性自发性结肠炎模型中，连续14天给予Paquinimod同样显著改善结肠组织学炎症 (图6F、6G)。研究从遗传和药理学两个层面系统阐明，S100A8/A9同源二聚体依赖适应性免疫细胞 (特别是T细胞) 驱动肠道炎症，而靶向抑制S100A9可同时缓解急性和慢性实验性结肠炎，为IBD的免疫靶向治疗提供了强有力的临床前依据。

图6. 人S100A8和S100A9同源二聚体的致结肠炎作用需要适应性免疫。

粪便中S100A8与S100A9二聚体不仅可能是肠道炎症的新型生物标志物，也是IBD的潜在抗炎治疗靶点。未来仍需开展以大样本、内镜终点为指标的大型对照试验，以确立靶向S100A8/S100A9在IBD诊断或治疗中的临床价值。