作者：张晖，李乐，方云，杨宁，苑鑫等，解放军总医院第五医学中心感染病医学部/国家感染性疾病临床医学研究中心

支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)技术，亦称液相活检，是一种通过常规纤维支气管镜向支气管局部(如支气管以下肺段、亚肺段)肺泡内灌注无菌生理盐水，随后抽吸并回收肺泡表面液体的方法，所获液体称为支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)［1 ］ 。BALF是一种优质的临床检测标本和科研样本，富含各类可溶性蛋白、生物活性介质、细胞因子及酶类等。离心后的上清液可用于化学和免疫学检测，而沉淀物则适用于细胞形态学、病原学及分子生物学等分析。深入理解BALF的生物学特性和临床意义，对于下呼吸道感染的诊断、预后评估、发病机制研究以及新型检测技术的应用具有重要价值［2-3］ 。

BALF样本作为生物样本库的重要组成部分，具有显著的转化应用潜力。在进行BALF样本保藏时，需充分考虑其独特的生物学特性和潜在的生物安全风险。参考BALF病原体检测、细胞学检查等技术规范和专家共识，结合《GB-T 37864-2019生物样本库质量和能力通用要求》，优化保藏条件，明确样本入库前的采集、制备、存储及生物安全等关键技术要点，可为下游研究提供高质量、可靠样本基础［4］ 。

1 BALF样本保藏的关键技术要点

1.1伦理准备

临床BALF样本的采集、存储和利用涉及患者隐私和权益保护。在保藏活动启动前，应根据研究目的和队列设计，明确样本来源和利用需求。达成充分知情并通过伦理审查，保证样本使用符合伦理规范和法律法规要求，确保保藏过程的安全性和有效性。

1.2生物安全

来自临床呼吸道感染疾病患者的BALF样本通常携带致病病原微生物，具有一定的传染性。特别是在病因和流行病学特点不明的情况下进行样本保藏，可能面临职业暴露风险。保藏人员应建立生物安全防护屏障，完成生物安全风险评估，并根据不同生物安全级别采取相应防护措施。所有人员应熟悉个人防护装备的正确穿戴流程，若防护装备破损，应及时更换［5］ 。

若在采集、转运、制备、存储过程中发生样本溢洒，应立即对污染环境和设备进行消毒处理。首先使用含氯消毒液覆盖溢洒区，再用75%酒精消毒和紫外线对空气进行消毒，随后上报并重新取样，确保处理步骤符合生物安全要求。BALF样本制备过程中产生的医疗废物和废液，需使用适当浓度的含氯消毒液处理，并根据样本的生物学特性和潜在危害性选择适当的销毁方式，确保流程安全［6-7］ 。

1.3样本采集

参考支气管肺泡灌洗液细胞形态学检验专家共识和细胞学检测技术规范，样本采集需注意以下要点:(1)回收率应＞40%;若选择肺下叶或其他肺叶肺段灌洗，回收率应＞30%。(2)避免混入血液，红细胞数量应＜10%，上皮细胞应＜5%。(3)多部位灌洗时，需注明灌洗部位和冲洗液;若黏液较多，弃去第1管。(4)若考虑大气道疾病，建议单独处理第1管回收液;非大气道疾病时，可将所有样本混合后分送。(5)采集样本量，成人通常不少于10 m L，儿童不少于3 m L。根据检测目的或保藏要求，选择适当的采集容器。用于病原学分析的样本需使用无菌容器，而常规细胞学分析则需选择硅化塑料容器或涂硅灭菌玻璃容器以减少细胞粘附。采集结束后，贴好样本信息标签和交接单，及时送至样本库;若2 h内无法转运，需将样本暂时存放于4℃冰箱，临时存储时间不超过24 h［8］ 。

1.4样本转运与交接

每次转运BALF样本前，需使用75%酒精对转运箱或包装材料进行消毒，确保其清洁，避免其他病原微生物污染。样本库保藏人员收到样本后，需确认知情同意书和交接单信息(如姓名、ID、灌洗部位、采集日期和时间、样本容器状态等)，并检查样本是否暴露于影响质量的环境温度中。对标识不明或采集量不足的样本，可执行拒收程序;部分不合格样本可让步接收，并与临床沟通，记录样本状况对保藏结果的影响［9］ 。

1.5样本制备和存储

根据临床样本队列项目和科研需求进行样本制备。在4℃条件下，以500×g离心10 min。使用一次性吸管吸取上清液，分装于冻存管中，置于－80℃超低温冰箱长期存储。剩余沉淀物可加入适量冻存液，存储于－80℃冰箱;或完全浸入10%中性福尔马林固定，以备细胞蜡块制作;还可制作沉淀物涂片或电镜样本超薄切片，分类存储。

1.6样本质量评测

获取样本后，首先进行外观性状的肉眼观察并详细记录。正常BALF应为无色透明液体，无杂质、溶血或冰冻现象，无大量大气道分泌物混入。若颜色异常，如淡黄色或黄色提示肺部感染或脓性样本;血性或棕褐色提示急性弥漫性肺泡出血;乳白色或淘米水样，放置15～20 min后出现絮状颗粒物沉淀，则提示肺泡蛋白沉积症。

应根据科研项目、样本预期用途和保藏实际情况，选择适宜的目标分析物进行质量评测。上清样本多用于可溶性物质分析，如蛋白质、代谢物、细胞因子或DNA/ＲNA提取，进行纯度和活性评测［10］ 。沉淀物以细胞为主，常用于培养、病理或流式细胞分析。2003版《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范》已明确BALF细胞总数和分类计数的技术规范。随着流式细胞分析和单细胞测序技术的应用，对BALF样本的采样和制备提出了更高要求。为确保测序质量，需从样本数量、活性和纯度等方面综合考虑，选择状态良好、活性高的细胞，确保后续测序时产生更多核酸序列，增加测序深度。推荐使用自动细胞计数仪定量分析并记录细胞总数、有核细胞数、细胞存活率、结团率和碎片干扰等情况［11］ 。

2 BALF样本资源在临床科研中的应用

2.1病原学分析

病原学是研究病原体和宿主相互作用的重要手段。BALF样本中的病原体(如病毒、细菌和真菌等)可在适当保藏条件下保持活性，满足后续研究和利用需要。有研究团队结合临床资料(如患者病史、肺CT影像等)，利用宏基因组二代测序(metagenomics next-generation sequencing，m NGS)技术比较了肺部感染患者CT引导下经皮肺穿刺活检组织与BALF的病原检出率，结果显示BALF的病原检出率优于组织样本［12］ 。m NGS作为一种非靶向的广谱病原学筛查技术，通过对临床BALF样本中的核酸进行测序，并与微生物参考基因组比对，能够获取样本中的微生物物种组成及丰度信息［13-14］，在临床感染性疾病的病原体溯源、检测、分型和耐药评估等方面具有显著优势，特别是在疑难和罕见病的诊疗、传统病原学检测无法明确诊断的情况下，或出现聚集性呼吸道传染性病例需溯源时，其应用价值尤为突出。目前，大多数研究者通过存储样本并寄送至指定第三方实验室进行集中分析，这对样本质量要求极高，其结果准确性受采样、实验操作流程、存储条件、病原体参考基因组数据库及生物信息学分析等多种因素影响［15］ 。

2.2病理学分析

BALF样本中的细胞和蛋白质等可反映肺部的病理变化，为疾病的诊断和分子病理机制研究提供依据。细胞蜡块技术已广泛应用于胸水、腹水、脑脊液及肺泡灌洗液等样本的制备，具有较高的病理回溯价值，是病理学研究中的重要样本类型［16-17］ 。有研究团队收集了2020年2—5月期间14例COVID-19患者的BALF样本，在全流程生物安全二级防护措施下完成细胞蜡块制作。在制作过程中，2例BALF样本肉眼观察呈透明状，镜下观察细胞数量较少，随后通过离心、浓缩沉淀处理增加细胞数量，继续完成蜡块制

作。与传统涂片相比，利用细胞沉淀物制作的细胞蜡块相当于组织块，既可长期保存，也可连续切片，用于后续特殊染色、免疫组化染色及分子检测等，同时便于回顾性分析［18］ 。此外，2023版《肺泡蛋白沉积症细胞学病理诊断中国专家共识》对BALF样本的采集质量要求及处理方法进行了详细描述。新鲜BALF样本离心后，上清液可用于化学和免疫学研究，而团块状沉淀物经固定、脱水、石蜡包埋后，可制作成细胞蜡块或切片，其背景清晰、细胞集中，便于后续开展荧光原位杂交技术、免疫组化染色及电镜分析［19-20］ 。

2.3蛋白质组学分析

蛋白质组学分析在后基因组时代迅速发展，在呼吸道疾病的临床和科研实践中得到了广泛应用。BALF样本中包含多种细胞(如肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、鳞状上皮细胞、支气管上皮细胞、Ⅱ型肺细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)及可溶性成分(如脂质、核酸和蛋白质/多肽)。早在2005年，Wattiez等［21］ 综述了BALF蛋白质组的研究现状及其在分子水平肺结构研究和临床肺疾病研究中的贡献。2021年，Mayr等［22］建立了多个大型肺纤维化患者队列，收集患者肺泡灌洗液和配对血浆，利用质谱技术完成蛋白质组学分析，并整合单细胞转录组学数据，发现了与诊断、肺功能和损伤状态相关的蛋白质生物标志物特征，同时基于单细胞分析预测了这些蛋白质的细胞来源。通过机器学习，证明蛋白质组特征可预测肺中特定细胞状态的变化。然而，BALF样本中的可溶性成分易受患者黏液、灌注液成分、灌洗过程、灌注量、回收量及肺泡上皮通透性等因素干扰，限制了基于质谱的BALF蛋白质组学深度分析的临床价值。Weise等［23］

收集了慢性阻塞性肺疾病患者的BALF样本，优化了样本制备流程，开发了一种结合高丰度蛋白质消耗、蛋白质捕获、清除和原位胰蛋白酶消化的方法，为质谱分析提供了高质量的蛋白质和胰蛋白酶肽，适用于小体积样本(1～5 m L)的定性和定量蛋白质组学分析。该方法不仅支持研究人员将基于质谱的蛋白质组学应用于BALF临床样本的广泛研究，还为BALF样本保藏质量的保障提供了多角度借鉴。

2.4流式细胞分析

BALF样本中的免疫细胞分析有助于认识呼吸道疾病的免疫反应过程。当BALF中以中性粒细胞比例增高为主时，常见于感染性疾病;以淋巴细胞比例增高为主时，则多见于结节病、放射性肺炎等。在细胞数量充足的情况下，可利用流式细胞仪进行细胞学分析。有研究团队结合患者临床表现，通过对BALF的细胞组分及淋巴细胞亚群分析，评估肺部感染、肺恶性肿瘤及间质性肺病患者的细胞计数及淋巴细胞亚群表达水平，深入了解肺部病变的免疫功能，为疾病诊断及预后提供指导性依据［24］ 。在另一项关于重症肺炎的研究中，研究者收集了相关临床资料［如性别、年龄、急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(acutephysiology and chronic health evaluationⅡ，APACHE Ⅱ)、氧合指数等］，结合流式细胞仪分析BALF中白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ等细胞因子指标，并进行回顾性分析。结果显示，BALF中IL-17A水平和APACHEⅡ评分可作为影响重症肺炎患者预后的独立危险因素，其变化与疾病严重程度相关，对重症肺炎患者预后的预测具有重要价值［25］ 。

3挑战与展望

随着病原学、病理学、蛋白质组学、基因组学等学科的快速发展，BALF样本作为一种优质的生物样本资源，正逐步在流式细胞分析、免疫组化分析、高通量测序等技术中得到广泛应用。与外周血和组织样本不同，BALF样本具有独特的生物学特性，其采集方式、灌洗液量、转运条件及制备流程等环节，均是确保样本保藏质量并满足未来科研需求的关键因素。

目前，针对BALF样本保藏的经验仍缺乏统一共识。样本库需进一步加强多学科合作与交流，结合临床诊疗和科研的实际需求，从不同角度对BALF样本进行全面分析和解读。通过优化样本保藏的质量评测内容，确保样本质量的稳定性和可靠性，从而提升BALF样本的保藏价值和长期利用潜力。未来，随着技术的不断进步和标准化流程的完善，BALF样本将在呼吸道疾病的精准诊疗和机制研究中发挥更加重要的作用。

作者贡献:张晖负责文献检索、论文撰写;李乐、方云、杨宁负责文献检索、论文校对;苑鑫、刘妍负责研究设计、审校论文。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略。

来源：张晖,李乐,方云,等.支气管肺泡灌洗液样本的保藏与利用[J].协和医学杂志,2025,16(06):1587-1592.

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