HCC作为全球发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，其病因复杂，除慢性乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染外，代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎及肠道菌群失调等因素也被证实与之相关。肠-肝轴作为连接肠道与肝脏的关键生理通路，在肝脏疾病发生发展中发挥核心作用——肠道菌群失衡可导致肠道屏障功能受损（“肠漏”），使细菌及其代谢产物通过门静脉进入肝脏，引发慢性炎症和肝细胞损伤，最终促进肝癌发生。

近年来，多项研究发现HCC患者存在显著的肠道菌群紊乱，例如产脂多糖（LPS）细菌增多、益生菌减少等，但具体哪些细菌可直接驱动肝癌发生、通过何种机制发挥作用，尚未得到明确阐释。此前研究多聚焦于菌群代谢产物的间接作用，而对细菌本身是否可易位至肝脏并定植、与肝癌细胞直接相互作用的研究较为匮乏。因此，鉴定HCC相关的特异性致病菌、阐明其致病机制，对于完善HCC病因学理论、开发新型诊断标志物和治疗策略具有重要意义。

中山大学附属第一医院与香港中文大学联合研究团队通过对HCC患者和健康人群的粪便及组织样本进行菌群测序，筛选出差异富集的候选细菌，并通过一系列体内外实验系统验证其致癌作用及分子机制，填补了肠道细菌直接驱动肝癌发生的研究空白。

‌1. C. mitsuokai在HCC患者粪便和肿瘤组织中显著富集‌

为识别HCC中潜在的致病细菌，该研究对52名HCC患者的肿瘤组织和粪便，以及50名健康捐赠者的肝组织和粪便进行了16S rRNA测序。分析发现，链状菌属（Catenibacterium）在HCC患者的肿瘤组织和粪便中均显著升高，而Catenibacterium属中唯一已知的潜在致病菌是C. mitsuokai，一种存在于人类肠道中的革兰氏阳性厌氧菌。值得注意的是，在36份粪便样本中有12份（33.3%）和38份肿瘤样本中有5份（13.2%）检测到C. mitsuokai，更重要的是，有5名患者（13.2%）的粪便和肿瘤样本中同时鉴定出C. mitsuokai，这表明可能存在通过肠-肝轴的微生物易位。此外，与癌旁肝组织相比，C. mitsuokai在肿瘤组织中显著富集。这些结果表明C. mitsuokai是HCC中一个上调的潜在致病菌。

‌2. C. mitsuokai在多种HCC小鼠模型中促进肿瘤生长‌

为探索C. mitsuokai在HCC发展中的潜在功能，该研究建立了使用小鼠HCC细胞系RIL175的HCC原位小鼠模型。与阴性对照组相比，C. mitsuokai处理的小鼠表现出更强的生物发光强度，并在终点时肿瘤重量和体积增加。为了验证C. mitsuokai的促瘤作用，研究人员使用了第二个原位HCC模型（小鼠Hepa1-6细胞），同样证实C. mitsuokai灌胃加速了原位Hepa1-6肿瘤的生长，表现为生物发光强度增加以及肿瘤重量和体积增大。

为了确定C. mitsuokai是否能加速代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）相关的HCC，该研究建立了营养性肝癌发生的STAM模型，发现C. mitsuokai灌胃的小鼠与对照组相比，血清甲胎蛋白（AFP）水平显著升高，肿瘤数量、肿瘤体积和最大肿瘤长度均显著增加，表明C. mitsuokai也能促进MASH相关的HCC。总之，C. mitsuokai可以在各种动物模型中促进HCC进展。

‌3. C. mitsuokai通过至肝脏促进肿瘤发生并‌破坏肠道屏障

肠道屏障完整性是阻止肠道细菌向肝脏迁移的关键。研究发现，C. mitsuokai灌胃可显著增加常规小鼠和无菌小鼠的肠道通透性，表现为4kDa和500kDaFITC-葡聚糖的肠道转运效率升高，门静脉中LPS水平增加。机制上，该细菌可减少结肠黏膜中黏蛋白Mucin2的表达，破坏肠道黏液层完整性；同时下调紧密连接蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、闭合蛋白（occludin）和Claudin-3的表达，导致肠道上皮细胞间连接破坏，透射电镜（TEM）进一步证实了肠道上皮紧密连接和黏附连接的结构紊乱。

通过Cy5.5-赖氨酸标记细菌的体内示踪实验发现，Mitsuokai链状菌灌胃后可在小鼠肝脏中检测到荧光信号，且从肝脏组织中成功分离培养出该细菌，证实其能以活菌形式易位至肝脏。进一步分析表明，Mitsuokai链状菌主要破坏空肠、回肠和结肠的屏障功能，而对胆道、胃和十二指肠无显著影响，提示其主要通过下消化道易位至肝脏。

‌4. C. mitsuokai表面蛋白Gtr1/RagA通过与HCC细胞上的γ-catenin结合促进其肝内定植‌

细菌在肝脏中的定植是其发挥致癌作用的前提。细胞黏附实验显示，C. mitsuokai对肝癌细胞（PLC5、Huh7）的黏附能力显著高于正常肝细胞（MIHA），TEM观察到细菌与肝癌细胞间形成明确的病原体-宿主相互作用界面。通过蛋白质谱分析筛选出C. mitsuokai的表面蛋白Gtr1/RagA，GST下拉实验和表面等离子体共振实验证实，该蛋白可与肝癌细胞表面的γ-连环蛋白（γ-catenin）直接结合，结合亲和力达32.4nM，分子对接分析显示二者具有良好的结合构象。

功能验证实验表明，通过sgRNA敲低肝癌细胞中的γ-catenin后，C. mitsuokai对肝癌细胞的黏附能力显著降低，证实Gtr1/RagA-γ-catenin相互作用是该细菌在肝内定植的关键机制。

‌5. C. mitsuokai分泌QA激活 TIE2/PI3K/AKT 通路

为明确C. mitsuokai发挥致癌作用的效应分子，研究团队对细菌条件培养基（CM）进行分析，发现其对肝癌细胞的促增殖作用可通过Transwell膜（物理隔离细菌与细胞）传递，且加热或蛋白酶K处理后仍保留活性，提示效应分子为非蛋白类小分子。通过非靶向代谢组学分析，筛选出在细菌CM、感染细菌的小鼠肿瘤组织和粪便中均显著富集的代谢产物——QA。

体外实验证实，QA可浓度依赖性地促进肝癌细胞增殖和集落形成，加速细胞周期G1-S期转换，抑制凋亡相关蛋白的表达。机制研究表明，QA可与肝癌细胞表面的TIE2受体结合，激活下游PI3K/AKT信号通路，表现为p-TIE2、p-PI3K和p-AKT蛋白水平显著升高。通过sgRNA敲低TIE2或使用TIE2抑制剂，可完全阻断QA和C. mitsuokai 对肝癌细胞的促增殖作用及PI3K/AKT通路激活。

体内实验进一步验证，在Hepa1-6细胞原位移植模型中，TIE2抑制剂可显著逆转C. mitsuokai的促肿瘤作用，降低肿瘤体积和重量，同时抑制肿瘤组织中PI3K/AKT通路激活，证实QA-TIE2-PI3K/AKT轴是该细菌致癌的核心机制。

该项研究确定了C. mitsuokai是富集于HCC的一种致病菌。C. mitsuokai破坏肠道屏障，并以Gtr1/RagA-γ-连环蛋白作为活细菌定植HCC细胞。C. mitsuokai衍生的代谢物QA与酪氨酸激酶受体TIE2结合驱动下游PI3K/AKT通路，从而促进HCC发展。

这项工作首次证明了C. mitsuokai通过破坏肠道屏障、结肠化HCC细胞和分泌QA激活下游TIE2/PI3K/AKT通路，从而促进HCC进展。C. mitsuokai诱导肠道屏障功能失常，使其能够以活菌形式易位至肝脏，并在其中实现活菌定植。更重要的是，C. mitsuokai分泌的QA作为致癌代谢物激活TIE2/PI3K/AKT信号传导，为理解HCC中肠道微生物的作用机制提供了重要见解。未来的研究将进一步验证C. mitsuokai在不同人群中的分布特征，并探索靶向TIE2通路对HCC患者的临床治疗价值。

审批编号：CN-171823

有效期至：2026/11/18

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