作者：石玉如，戚应杰，
宏基因组下一代测序（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒ⁃ａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｍＮＧＳ）作为一种新兴的高通量测序技术，具备独特优势，能够在无需依赖培养的前提下，直接从临床样本中精准获取微生物的遗传信息［１］，为复杂感染的检测开拓了新路径。相较于传统检测方法，该技术能够更高效地识别多种病原体，包括罕见、新发和多重感染病原体，从而显著提高诊断的准确性与时效性［２］。近年来，随着国内外一系列关于宏基因组测序临床应用共识的发布［３⁃８］以及国家相关政策的出台，为了降低标本外送所带来的政策监管风险、结果解读风险和生物安全风险，越来越多的医疗机构开始布局宏基因组测序技术的本地化应用。但是在ｍＮＧＳ本地化检测过程中可能会遇到一系列问题，本文根据我们的实际经验，结合国内外参考文献，提出相应的解决方案，以供同行参考。
１ ｍＮＧＳ建库试剂临床本地化使用的合规性
ｍＮＧＳ技术是一种颠覆性的技术，可检测的病原体种类高达３万余种，难以使用传统微生物学检测技术对其进行性能确认。因此，国内目前尚无一款ｍＮＧＳ建库试剂盒获得国家药品监督管理局（ＮａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＮＭＰＡ） 的正式批准，这使ｍＮＧＳ建库试剂临床本地化合规使用面临巨大挑战。
２０２１年中华人民共和国国务院发布的《医疗器械监督管理条例》第五十三条明确规定：“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。”传统实验室自建检测方法（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｅｓｔ，ＬＤＴ）是指临床实验室自行研发、验证，并仅限于在本实验室使用的检测方法。近年来，ＬＤＴ内涵和理念发生了巨大改变，美国已将体外诊断试验中新技术的应用纳入ＬＤＴ管理［９］。目前，我国尚无ｍＮＧＳ⁃ＬＤＴ的国家标准和行业标准。２０２４年由中国药师协会、中华医学会细菌感染与耐药防治分会、国家卫生健康委临床抗微生物药物敏感性折点研究和标准制定专家委员会共同起草并发表了《病原宏基因组高通量测序临床本地化检测规范专家共识》［１０］，指出ｍＮＧＳ可按照实验室自建检测方案的要求进行使用和管理。该共识就ｍＮＧＳ⁃ＬＤＴ的流程搭建、性能确认、质量控制、报告审核等方面形成共识，并提出规范的要求和建议，为ｍＮＧＳ技术在临床微生物检测中的应用提供了指导。开展ｍＮＧＳ本地化检测的实验室可以按照该共识要求执行。
２ 测序平台和自动化仪器的选择
在选择测序平台时，优先选用ＮＭＰＡ批准的测序平台及配套试剂［１１］。目前国内的主流测序平台包括ＤＮＡ纳米球测序（如ＭＧＩ平台）、边合成边测序（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳＢＳ，如Ｉｌｌｕｍｉｎａ平台）以及半导体测序（如ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ平台）［１２］。应注意不同测序平台的测序方案存在差异，例如，病原宏基因测序中ＭＧＩ平台通常会选择ＳＥ５０测序模式（单端５０碱基读长），Ｉｌｌｕｍｉｎａ平台则多选择ＳＥ７５测序模式（单端７５碱基读长）。
除此之外，还需要综合考量多种关键因素，如测序通量、准确性、检测周期、检测成本以及数据安全性等。从测序成本上，需考虑仪器本身的成本、试剂耗材的成本以及运行维护成本（包括仪器保养、校准及零配件损坏后的更换等）。在数据安全方面需考虑数据储存方式（如磁盘存储、云存储）的安全性以及对患者遗传信息的隐私保护［１３］。本实验室根据标本量的增长，陆续升级了测序仪器，从ＢＧＩＳＥＱ⁃５０到ＢＧＩＳＥＱ⁃２０００，下机数据量明显提升。为了缩短实验室内周转时间，本实验室目前使用ＰＭＳＥＱ⁃４５００，测序时间仅需６ｈ。
ｍＮＧＳ的湿实验环节包括标本前处理、核酸提取、文库构建及上机前准备等步骤，手工操作时间大约６～１０ｈ。由于操作时间长、步骤繁杂，建议根据标本量，选择通量不同的核酸提取建库自动化仪器或者全自动测序系统，以减少环境背景菌污染，保证加样移样量的一致性，提高工作效率。但在自动化仪器使用过程中，应密切观察加样、转样及ＰＣＲ升降温等情况，做好日常的保养和定期的维护校准。本实验室在开展ｍＮＧＳ本地化检测的早期采用的是手工操作，在实验过程中由两名实验员进行双人核对操作。但即使如此，也很难保证操作的准确性和一致性，过程污染时有发生。随着标本量的增长，我们使用了建库仪ＭＧＩＳＰ⁃１００，一次性可处理１６个标本，标本前处理后即可上建库仪，从标本提取到标本出库仅需４～５ｈ。
３ ｍＮＧＳ测序下机数据的分析及报告解读
在一次ｍＮＧＳ测序实验过程中，会生成数十亿条序列数据，这些数据不仅体量巨大，还包含大量的冗余信息和噪声［１４］。由于各医疗单位没有专业的生物信息学分析人员，建议采用智能分析软件进行初步分析。该软件应具备ＮＭＰＡ认证资质。从原始序列到获得非人源高质量序列并进行物种注释，需要依次经过以下环节：标签识别、测序数据质量和测序深度评估、低质量序列过滤、去人源核酸序列、高质量序列比对等标准化流程［１５］。实验室应定期更新背景菌库，并将背景菌信息上传至软件，以便在分析数据时能够直接过滤背景菌。对于分析完成的数据，要进行下机质控，只有符合质控要求的数据才能用于报告解读。
从本实验室的经验来看，报告解读需要注意以下几个方面。（１）不同标本类型应分类解读，尤其是对来源于非无菌部位的标本，要注意区分定植菌和致病菌。但在某些情况下，定植菌有可能是致病菌，因此当发现定植菌比例异常增高时，应结合患者的临床表现和其他检查结果综合判断。（２）对于ｒｅａｄｓ数较低但明确具有致病性的病原体，需要调出原始数据，以排除同批检测高浓度的标本发生的标签跳跃（ｉｎｄｅｘｈｏｐｐｉｎｇ）。（３）对于同属但不同种的病原体，其致病性存在差异，可通过多序列比对或特异性引物验证进行确认。（４）真菌和寄生虫拥有庞大的基因组，容易与人类宿主序列混淆，并且可能以低丰度存在于临床标本中，这给ｍＮＧＳ检测结果解读带来了较大的挑战［１６］，可通过优化数据库（如增加真菌和寄生虫参考基因组）或增加测序深度，以提高病原体的覆盖度，提高判读的准确性。
相较于第三方机构，本地化检测报告解读时，可以通过ＨＩＳ／ＬＩＳ系统了解患者的病史、临床症状、其他实验室检测结果（包括
４ ｍＮＧＳ本地化检测的质量控制
４．１ 内部控制 在提取标本前，将唯一可识别的基因组核酸作为内参加入每个标本中，使其成为整个实验过程的“质量核查者”，作为质控的关键要素，内参中不应包含任何潜在致病性微生物的核酸片段。
４．２ 外部控制 包括阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品用于监测外部环境、试剂微生物污染以及标本的交叉污染情况；阳性质控品用于监测核酸提取、文库制备过程以及生物信息学分析中可能出现的问题。阳性质控品应尽量选择不致病的微生物核酸基因组。
４．３ 过程控制 过程控制和检查点可在ｍＮＧＳ实验的多个关键节点发挥作用，以确保在进入下一步分析之前，材料的质量符合要求。重要的过程控制及检查方法见表１。在测序运行之前，这一点尤为重要，因为测序所使用的试剂成本相对较高，重复测序会显著增加成本。
４．４ 污染控制 污染微生物可能存在于试剂、实验室器具［１７］、环境或正常的人类菌群中。由于ｍＮＧＳ的高敏感性，即使是微量的外部污染也可能在测序数据中显现。在实验的每一个步骤都有可能引入污染。因此，标本不仅要以无菌方式处理，还要尽可能避免外源核酸的污染。ｍＮＧＳ实验中使用的所有试剂和一次性用品都存在被污染的风
险。因此，详细记录批号并在发生污染时及时更换材料是关键任务；每次实验都应带有阴性对照，解读报告时严格核对其下机原始微生物列表。同时，建议定期进行实验室环境评估，以评估实验室环境中可能存在的污染情况，其中高速离心机、生物安全柜、孵育器等设备是最容易受到污染的地方，需要特别关注。此外，污染还可能来源于同批次的高浓度标本，一种可能是在测序过程中发生标签跳跃，即分配给一个标本的ＤＮＡ分子及其对应的唯一标签在分配给另一个标本的标签下呈现［１８］；另一种可能是在湿实验中，高浓度标本产生的气溶胶造成污染，影响了样本编号前后邻近的标本。因此，当遇到高浓度标本时，需要密切关注交叉污染，防止出现假阳性结果。
４．５ 数据库质量控制 鉴于基因库的持续增长，数据库也需要不断更新。尤其是对于罕见病原体，通常仅对其特定基因或基因组的有限区域进行了测序，这就限制了与参考序列比对时的检测灵敏度。所以，定期更新参考数据库至关重要。即使是对参考数据库的微小更新，也需要进行版本控制，并且可能需要重新验证生物信息学分析流程，因为这些更新可能会影响ｍＮＧＳ分析结果的准确性。４．６ 生物信息学分析质量控制 生物信息学数据分析的关键环节包括标签识别、序列拆分、接头及低质量序列过滤、数据量评估、测序深度及灵敏度分析、人源序列去除和微生物序列注释［１５］。因此，在下机时，应对碱基质量（Ｑ３０）、下机数据量、测序深度等关键指标进行严格评估。
５ 降低单个标本的测序成本
在病原体宏基因组测序实验中，成本主要集中在核酸提取、文库制备以及上机测序等环节。尽管成本会因ｍＮＧＳ设计的不同而有所差异（如测序区域的大小、测序深度以及测序操作的规模等），但一般来说，在分析运行中包含的标本数量越多，每个标本的成本就越低。然而，通过积压标本降低开机成本，必然会对实验室内周转时间产生影响。本实验室从以下３个方面着手解决这一问题。（１）根据每日不同的标本量，选择不同测序通量的芯片。如每日标本量在８个以内，可选择ＤＮＢＳＥＱ⁃Ｇ９９平台测序芯片，支持双载片测序模式，测序通量在１００Ｍｒｅａｄｓ（单载片）～２００Ｍｒｅａｄｓ（双载片），最快测序时间为３ｈ；如果日标本量在８～１６个之间，可选择ＭＧＩＳＥＱ⁃２００平台，测序通量可达到５００Ｍｒｅａｄｓ以上；如果日标本量在２０个以上，可选择更大通量测序平台，如ＭＧＩＳＥＱ⁃２０００／ＰＭＳＥＱ⁃４５００测序平台，单张芯片可达１６００Ｍｒｅａｄｓ以上的测序数据量，支持双载片同时上机，单载片最大支持４８个标本的宏基因组检测。（２）合理安排开机时间，例如选择当天所有标本都送达实验室后的下午或傍晚开始实验，确保当天所有样本都能上机检测。（３）如开展有靶向测序，可考虑将宏基因组测序与靶向测序共用同一张芯片，以降低开机成本，共机时要注意分ｌａｎｅ，由于靶向测序需要的下机数据量不高，可单独分一条ｌａｎｅ即可，这样无论在上机测序还是在下机数据分析中都更加方便，也避免相互干扰。
６ 结语
病原体宏基因组测序技术已展现巨大的发展潜力，特别是在疑难危重感染病例诊断、新兴病原体快速识别鉴定以及病原体流行株和突变株监控等方面发挥着至关重要的作用。然而，当前该技术的应用尚缺乏统一的行业标准和质量标准，要求临床实验室在开展ｍＮＧＳ本地化检测之前做好人员培训、建立操作规程，完成性能确认，在实际工作中不断总结经验，提高检测水平，以保证该技术良性、有序、规范化应用。
参考文献略。
来源：临床检验杂志２０２５年９月第４３卷第９期
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