来源：IBD Daily

LRRK2 (富含亮氨酸重复激酶2) 基因突变是帕金森病 (PD) 的主要遗传风险因素之一，其编码蛋白通过调控内溶酶体通路中的膜转运及磷酸化RAB GTP酶参与细胞膜系统稳态的维持。既往研究发现，LRRK2的N2081D变异与克罗恩病 (CD) 风险相关，提示该基因在神经退行性疾病与炎症性肠病 (IBD) 中具有遗传多效性。本研究通过对多个大型生物样本库的数据进行关联分析验证了这种多效性，并构建携带N2081D突变的小鼠模型，以进一步阐明该变异通过影响LRRK2功能而增加CD风险的分子机制，以及其与帕金森病相关G2019S变异在致病表型上的差异。

研究者采用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6小鼠中构建携带N2081D突变的敲入模型，并通过葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱导性结肠炎模型评估其肠道炎症反应。研究结合组织学分析、免疫印迹、ELISA及蛋白组学检测，对结肠及脑组织中的RAB蛋白磷酸化水平和免疫反应进行了定量分析。在机制验证方面，研究者在HEK293细胞及骨髓来源树突状细胞 (BMDCs) 中表达不同LRRK2突变体，检测其自磷酸化与底物磷酸化活性，并利用共聚焦显微镜观察LRRK2在炎症刺激 (zymosan) 下的定位与信号变化。此外，通过敲除Rab12基因或应用LRRK2激酶抑制剂MLi-2，比较不同干预策略对结肠炎表型的影响，从而探讨潜在的治疗靶点。

➤CD和PD相关LRRK2变异的关联分析揭示其遗传多效性

在BioMe、UK Biobank和美国退伍军人百万计划 (MVP) 三大生物样本库中，研究者分析了LRRK2基因G2019S和N2081D变异与CD及PD的关联。纳入逾 100万名个体的多种族荟萃分析显示，N2081D变异同时增加CD和PD的发病风险，而G2019S主要与PD风险升高相关，并在部分欧洲人群中也与CD有关。由于不同族群的等位基因频率差异，UK Biobank未观察到相同结果。总体而言，这些发现进一步证实了LRRK2在CD与PD中的遗传多效性。

➤LRRK2^N2081D小鼠对化学诱导性结肠炎的敏感性增强

研究者利用CRISPR/Cas9技术建立携带LRRK2-N2081D变异的小鼠模型，并使用2% DSS诱导结肠炎。结果显示，无论雄性或雌性，Lrrk2^N2081D小鼠均出现更明显的体重下降、结肠缩短和炎症加重，雄性表现尤为显著，其粪便中促炎标志物lipocalin-2升高，脾脏重量增加，提示免疫反应增强。组织学分析进一步证实Lrrk2^N2081D小鼠的炎症和组织损伤程度均高于野生型和Lrrk2^G2019S小鼠，说明N2081D变异可显著加重DSS诱导的结肠炎。综上所述，Lrrk2^N2081D突变显著加剧了诱导性结肠炎的严重程度，并验证了该模型作为研究LRRK2相关克罗恩病致病致病机制的有效工具。

图1  验证LRRK2-N2081D基因敲入(KI)小鼠作为克罗恩病模型的可靠性

➤CD与PD相关LRRK2突变的功能效应存在显著差异

为比较N2081D与G2019S突变对LRRK2激酶活性的影响，研究者检测了两种敲入小鼠脑和结肠组织中LRRK2及其底物RAB蛋白的磷酸化水平。结果显示，G2019S突变显著增强了LRRK2-S1292的自磷酸化及RAB12的磷酸化，而N2081D突变则主要升高了RAB10的磷酸化水平，且在结肠组织中更为明显。并且研究者进一步分析表明，更加严重的炎症表型可能会放大N2081D的突变效应。深入探究其分子机制发现，N2081D与G2019S均可促进RAB10磷酸化，但具体机制不同：结构分析提示N2081D通过破坏LRR与激酶结构域间的相互作用而激活LRRK2。恢复该结构域间相互作用可降低RAB10磷酸化水平。

图2  PD与CD相关LRRK2变体的激酶活性特征分析

➤DC刺激诱导的LRRK2磷酸化及炎症反应具有突变依赖性差异

为探讨LRRK2突变在免疫细胞中的功能，研究者分离野生型、Lrrk2^G2019S和 Lrrk2^N2081D小鼠的BMDCs。在未刺激状态下，G2019S突变细胞中LRRK2-S1292自磷酸化及RAB12、RAB10的磷酸化水平均升高，而N2081D突变主要增强RAB10的磷酸化。这些结果表明，在HEK293细胞中揭示的LRRK2分子调控机制同样适用于敲入小鼠的BMDCs。为了验证炎症刺激是否能够激活LRRK2激酶活性，研究者使用促炎因子zymosan刺激三种不同基因型 (WT、G2019S、N2081D) 树突状细胞。结果显示，在zymosan作用下，三种基因型的细胞均出现NF-κB通路激活及RAB蛋白磷酸化增加，但后者效应存在差异：G2019S细胞中RAB12磷酸化显著升高，而N2081D细胞中RAB10磷酸化增强最为明显。上述结果表明，炎症刺激可激活LRRK2激酶活性，并导致底物磷酸化出现突变依赖性差异。研究者通过磷酸化蛋白质组学分析进一步发现，N2081D细胞中炎症相关蛋白 (如CCL22、CCR7、STAT4、TNFSF18) 水平较高，提示该突变可放大树突状细胞的促炎反应。共聚焦成像显示，zymosan被吞噬后，LRRK2定位于吞噬体膜表面，且N2081D细胞中磷酸化RAB10聚集更明显。总体而言，这些结果表明，炎症刺激可激活LRRK2激酶活性，而不同突变导致的底物选择性差异会引发不同的炎症信号响应。

图3  树突状细胞的激活会引发LRRK2突变依赖性的RAB磷酸化差异及炎症信号传导变化

➤LRRK2激酶抑制剂未改善结肠炎，而Rab12敲除可减轻炎症表型

为探索潜在的治疗策略，研究者首先在Lrrk2^N2081D小鼠中评估LRRK2激酶抑制剂MLi-2的作用。连续口服MLi-2能有效降低结肠组织中RAB10与RAB12的磷酸化水平，但对DSS诱导的体重下降、结肠缩短、组织损伤及脾重变化均无明显改善，提示单纯的激酶抑制并不能缓解N2081D相关结肠炎。

随后，研究者利用基因杂交获得Lrrk2^N2081D;Rab12^–/–双突变小鼠，以评估RAB12对LRRK2功能的调节作用。结果显示，Rab12敲除可显著降低结肠组织中RAB10的磷酸化水平，且BMDCs中也出现RAB10磷酸化水平降低，同时此措施可并明显减轻DSS诱导的体重下降、结肠炎症与组织损伤。综合结果表明，Rab12敲除能有效缓解N2081D突变相关结肠炎的严重程度，而LRRK2激酶抑制剂未能产生相同效果，提示靶向特定底物可能比直接抑制激酶活性更具治疗潜力。此外，野生型小鼠组中RAB12敲除未表现出明显的缓解效果，这表明此种干预策略可能对LRRK2突变携带者具有更好的治疗效果。

图4  RAB12基因敲除可挽救LRRK2-N2081D突变表型

本研究揭示，LRRK2-N2081D突变通过特异性增强RAB10的磷酸化活性，从而加剧了DSS诱导的结肠炎炎症反应。与G2019S突变不同，N2081D通过破坏LRR区与激酶结构域之间的相互作用激活LRRK2，表现出独特的分子机制。进一步研究发现，RAB12在调控N2081D相关炎症表型中发挥关键作用，其基因敲除可显著减轻结肠炎严重程度，提示其为潜在的治疗靶点。而LRRK2激酶抑制剂虽能降低底物磷酸化，但未明显改善炎症结局。

总体而言，本研究阐明了LRRK2在克罗恩病发病中的新型分子机制，并为针对LRRK2相关疾病的精准治疗提供了重要思路。

致谢

中南大学湘雅三医院 李文

中南大学湘雅三医院 项鑫 王思丹

中南大学湘雅三医院 陈杰

中南大学湘雅三医院 王晓艳

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