作者：李娟，韦旗，李景然，张影等，合肥市妇幼保健院，安徽医科大学第一附属医院东城院区泌尿外科

常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）是人类最常见的单基因遗传病之一，全球发病率大致在1∶1000~1∶400之间［1-2］。是一种慢性进行性疾病，以双侧肾脏进行性增大的多发肾囊肿为特征，直至发生终末期肾病，具有高度的异质性和迟发性［3-4］，目前已成为全球肾脏替代治疗的第四大常见病因［5］。

ADPKD是累及不同器官的全身性疾病，其所有表型多由PKD1或 PKD2基因突变所致，PKD1和PKD2分别编码多囊蛋白1（polycystin 1，PC1）和多囊蛋白2（polycystin 2，PC2）［6］。与 PKD2突变（占所有病例的15%）患者相比，PKD1突变（占所有病例的85%）患者的临床表型更严重，预后也更差［7-8］。PKD1 和 PKD2 基因存在高度的等位基因异质性，无突变热点，尤其是PKD1的新发突变的发生率更高，因此也增加了散发病例的发生率［9］。不幸的是，目前对于ADPKD尚无有效的治疗方法。为了预防遗传病患儿出生，避免治疗性引产给孕妇造成的身心创伤，针对有ADPKD家族史的夫妻，利用胚胎植入前遗传学检测（technology in preimplantation genetic testing，PGT）技术能精准阻断致病基因的遗传，从而实现优生优育的目的。由于PKD1基因的复杂性且无突变热点，因此为保障检测结果的精确性，防止因基因脱扣（allele dropout，ADO）和优势扩增等潜在干扰因素导致的漏诊或误诊，临床上运用结合致病基因位点的直接检测以及基于二代测序（NGS） 技术的遗传多态位点连锁分析。本研究在一个ADPKD家系中发现了一个新的PKD1基因突变位点，丰富了PKD1基因的突变谱，同时利用 NGS 对胚胎行单核苷酸多态性（SNP）连锁分析，移植胚胎后获临床妊娠并成功通过产前诊断检测，阻断了单基因遗传病在家系中的垂直传递。

1  资料与方法

本研究获得夫妻双方知情同意且已签署知情同意书，并经合肥市妇幼保健院医学伦理委员会审批通过（编号：syyxll-202204）。

1.1  研究对象  女方，30 岁，无 ADPKD 表型；男方（先证者），29 岁，有 ADPKD表型。女方2016年胚停自然流产（未做绒毛染色体检查），2018年、2020年生化妊娠2次。男方家系内多名成员（母亲、小姨和表弟）为 ADPKD 患者。男方外公 65 岁因多囊肾肾衰竭死亡（ 具体不详）。男方行全外显子检测，通过Roche KAPA HyperExome 芯片对目标基因外显子及临近剪切区的 DNA 进行捕获和富集，MGISEQ-2000测序平台进行变异检测。对家系先证者的母亲、表弟和 1 名正常个体进行 Sanger 测序验证。为了避免致病基因的遗传，该夫妇2023年在合肥市妇幼保健院生殖医学中心遗传咨询后，要求进行PGT助孕。

1.2  方法

1.2.1  家系单体型构建  采集夫妻双方外周血DNA，在致病突变上下游 1M 区域内，筛选数十至上百个紧密连锁的SNP位点作为精准遗传分析的标记，并在线设计特异性引物（http：//www.ampliseq.com）。对目标区域进行多重PCR扩增，经连接、纯化、建库和NGS测序后，选择多个紧密连锁的遗传标记SNP位点，用于构建家系单体型。

1.2.2  体外受精和囊胚活检  女方采用拮抗剂方案控制性促排卵，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）36 h后经超声引导下取卵，采用卵胞浆内单精子注射（ICSI）方式授精，受精后采用序贯培养法继续培养至取卵后的第5天或第6天，选择D5、D6囊胚腔充分扩张的囊胚利用激光辅助，取5～8个滋养层细胞进行活检，随后按照标准流程，对单个胚胎进行单管玻璃化冷冻处理。

1.2.3  PGT单体型分析  对胚胎活检的滋养层细胞通过多次退火环状循环扩增（MALBAC）技术进行全基因组扩增（WGA），扩增成功后，通过Sanger测序直接鉴定致病突变c.2098-2A＞G和基于 NGS的 SNP 连锁分析鉴别携带突变的染色体进行单基因病胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing for monogenic disorders，PGT-M），为预防胚胎染色体异常可能导致的流产、死胎、畸形儿的发生，除检测PKD1致病基因外还进行拷贝数变异（copy number variation，CNV）检测以进行低深度非整倍体胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A），从而筛选未受累整倍体胚胎进行移植，报告范围为4 Mb及以上的片段缺失或重复，10 Mb及以上且嵌合比例大于30%的CNVs。剩余胚胎遵循夫妻双方意愿进行处理。

1.3  胚胎移植和产前诊断  基于胚胎形态学和 PGT 结果来选择胚胎进行冻胚移植。胚胎移植后第12天测血hCG，如hCG＞5 U/L ，诊断生化妊娠；胚胎移植后第30天超声检查，宫腔内见孕囊或（和）心管搏动者，诊断临床妊娠。孕18周羊膜穿刺术获得的胎儿DNA进行Sanger测序、核型和染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）验证 PGT诊断结果。

2  结果

2.1  遗传分析  男方（先证者）染色体核型和 CMA 结果显示： 46XY，无任何缺失或重复。男方全外显子检测结果显示PKD1基因c.2098-2A＞G的杂合变异，该突变目前尚无报道。家系内先证者的母亲、表弟和 1 名正常个体进行 Sanger 测序验证提示男方的母亲和表弟（小姨之子）均携带有相同致病基因，而男方的父亲以及女方基因检测结果正常，该新突变 与 ADPKD 疾病表型表现为共分离（图1～3）。根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）遗传变异分类标准与指南（PVS1+PM2+PP4+PP1），确定该突变为致病突变［10］。

2.2  家系单体型构建  在致病突变上下游 1M 的区域内选择30个紧密连锁SNP位点成功构建SNP 单倍型，用于区别确认正常及风险染色体单倍型

2.3  胚胎植入前遗传学检测结果  控制性超促排卵后获卵5枚，MⅡ数5枚，受精数5枚，2PN卵裂数5枚，获得3枚可供活检级别的囊胚，对3枚囊胚（分别编号E1、E2、E3）行胚胎活检后成功获得扩增产物。Sanger 测序结果显示：E1不携带 PKD1基因c.2098-2A＞G突变且为整倍体胚胎；E2携带PKD1基因c.2098-2A＞G突变且为嵌合型17号染色体单体，E3携带 PKD1基因c.2098-2A＞G突变且为整倍体胚胎（表1）。每枚胚胎在上下游1M区域内平均有超过30个SNP可用位点，而且胚胎的突变检测位点和SNP单体型的分析结果均一致（图4~图6）。综合分析后选择囊胚E1进行胚胎移植。

2.4  产前诊断与妊娠结局  冻胚周期移植囊胚E1。2024年6月12日移植后第11天血hCG值为717.72 IU/L；移植30 d经阴道超声：宫腔内可见一孕囊回声，大小为27 mm×16 mm×24 mm，胚芽：9.4 mm，心管搏动存在。在孕18周，在合肥市妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺术，羊水样本提取DNA，Sanger测序结果显示：胎儿染色体核型和结构均未见异常，且未携带PKD1基因c.2098-2A＞G突变。2025年2月在孕38+2周足月剖宫产一男婴，出生体重3600 g，Apgar评分10分，肾脏超声未发现明显异常，成功阻断ADPKD在家系中的遗传。

3  讨论

出生缺陷给病患家庭带来了沉重的心理压力和经济负担，已经逐渐凸显为一个重要的社会问题。据统计，约80%的出生缺陷是由遗传因素单独或协同作用所致。而遗传学研究能够为临床筛查、诊断和治疗提供精准的分子靶点。本研究中，我们以一个ADPKD家系为切入点，检测出PKD1基因的一个新突变c.2098-2A＞G。ADPKD是典型的常染色体显性遗传病，遵循孟德尔遗传定律，即使ADPKD患者的配偶正常，他们的子代仍有50%的概率患病，PGT可以实现早期预防、早期干预，是目前帮助ADPKD患者生育健康子代的最佳选择。我们利用SNP 单体型分析结合 Sanger 测序和高通量测序的方法开展PGT-M +PGT-A筛选出一个不携带致病突变的整倍体胚胎，解冻胚胎移植后获得临床妊娠，且已通过产前诊断检测。    

PKD1基因位于第16号染色体p13.3，全长约 52 kb，含有 46 个外显子，编码的PC1是由4303 个氨基酸残基构成的跨膜蛋白，可通过 Ca2+-NFAT、JAK-STAT和HDAC6 等信号传导途径促进上皮细胞分化，维持细胞极性，如PC1缺陷会干扰下游通路的正常信号传导，导致细胞异常增殖，从而引起囊肿持续增长并扩大［11］。ADPKD系新发突变率较高的一种疾病，该疾病的新发突变率可达10%~15%［12］，截至目前，ClinVar 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）中记录了3804种PKD1基因突变。本研究发现的突变c.2098-2A＞G是位于第10位内含子与第11位内含子之间的剪接位点，依据致病性突变预测原则，剪接突变可直接判定为致病性突变，并在家系中呈现基因表型的共分离现象。此外，我们发现的新突变 c.2098-2A＞G 与ClinVar数据库中记录的致病性突变 c.2098-1G＞C 在突变位置上相同，仅碱基改变不同，推测这两者的致病机制可能相似，均由于突变导致剪接位点发生变化，最终产生截短蛋白，使 PC1丧失功能，最终导致多囊肾病的发生。通过检索 PubMed、HGMD、ClinVar 等多个数据库，都没有发现任何关于该突变的报道，该新突变的发现拓展了PKD1基因的突变谱，针对这一突变实施PGT尚属首次。

PGT自1989年首次应用于辅助生殖技术以来，其技术革新和应用范围均实现了突飞猛进的发展［13］，它使产前诊断提前至植入前胚胎阶段，可避免因侵入性产前诊断带来流产、感染的风险以及反复人工流产或引产导致的孕产妇身心创伤。PGT是基于单细胞的遗传学分析，活检细胞DNA模板浓度有限，虽然WGA技术的出现为后续的遗传分析提供足量的 DNA模板，但采用基于PCR的Sanger测序

直接进行基因检测存在等位基因脱扣（ADO） 的风险，保真度不够，影响PGT的准确性，是导致胚胎误诊、漏诊或无法判断的最重要原因之一。因此，需要更灵敏的检测方法降低ADO率［14］。SNP是最常见的人类遗传变异形式，广泛分布于人类基因组中，平均每100~300 bp就有一个SNP［15］。由于 SNP 只有二态，更易于进行高通量分析。利用目标基因上、下游1~2M内 SNPs 作为遗传标记，可以区别确认正常及风险染色体单倍型。本研究，我们采用基于NGS 的 SNP 单倍型来验证 Sanger 测序结果，显著降低 MALBAC 过程中可能造成的 ADO 现象，有效提升胚胎PGT 诊断结果的准确性和可靠性。

胚胎染色体嵌合是公认的正常生物学现象［16］，在胚胎早期阶段最为常见，随着胚胎的发育，嵌合的发生率逐渐下降［17-18］。本研究获得的3枚囊胚中的1枚是嵌合型17号染色体单体，嵌合率与既往研究报道的一致［19-20］。目前，染色体嵌合已成为PGT中一个日益突出的问题，可能导致误诊和不良的妊娠结局［21］。有研究报道，部分染色体为嵌合体的胚胎移植后能临床妊娠，并活产健康的整倍体子代［22-24］。一方面单个胚胎滋养外胚层活检的3～8个细胞不能代表整个胚胎的染色体状态；另一方面，WGA 的扩增偏差、样品DNA 生物学变异性、测序方法和生物信息学方法都可能导致结果的假阳性；再者，嵌合体胚胎可能存在自我修正的机制［25-26］。但有临床研究表明，与移植整倍体胚胎相比，移植嵌合体胚胎的临床妊娠率、活产率下降，流产率升高［16］。目前指南及共识均建议，在患者无整倍胚胎可移植或整倍体胚胎已耗尽时，经过充分遗传咨询和知情同意下，嵌合体可作为移植的可选项［27］。本研究暂无上述情况，我们最终选择不携带致病基因且为整倍体胚胎进行移植。

综上所述，本研究以一个ADPKD家系为切入点，发现了一个新的PKD1基因突变，丰富了PKD1基因的突变谱，为该病的诊断及产前咨询提供依据。同时将基于NGS的SNP连锁分析进行PGT与侵入性产前诊断相结合，有效阻断ADPKD遗传缺陷的垂直传播，该技术准确、有效，为未来预防其他单基因遗传病提供了参考［28］。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  李娟：撰写文章及数据分析；洪名云：研究构思与设计；韦旗，张影：样本纳入和数据收集；李景然：数据分析指导；邹林兵、唐志霞：文章修改和协助完成研究

参考文献略

来源：李娟 ，韦旗，李景然 ，等.胚胎植入前遗传学检测在阻断PKD1基因新突变致常染色体显性遗传性多囊肾病家系遗传的研究［J］.中国实用妇科与产科杂志，2025,41(9)：946-951.

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