作者：中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部骨科康复科     宁超

关节软骨主要由细胞外基质和少量软骨细胞构成,基质的被动扩散是其获取营养物质的主要方式。由于其本身缺乏神经、血管及淋巴系统供应,且成熟软骨细胞的增殖能力有限,导致其自身修复能力较差。软骨损伤后主要表现为关节疼痛、肿胀和活动受限,严重影响患者的生活质量。对于年轻活跃的全层软骨损伤患者,手术治疗是必要的。现有修复技术主要包括骨髓刺激术、自体软骨细胞移植术、基质诱导自体软骨细胞移植术以及自体/同种异体骨软骨移植术。骨髓刺激技术形成的纤维软骨耐磨性较差,容易发生退行性改变。自体软骨细胞移植术/基质诱导自体软骨细胞移植术的复杂流程不仅增加了手术风险与治疗周期,也增加了医疗负担。此外,体外扩增过程易引发软骨细胞去分化,最终形成透明软骨/纤维软骨混杂的组织。自体骨软骨移植不会发生免疫排斥反应,但存在供区并发症、来源有限、移植物碎裂、匹配度欠佳等问题。因此,研发新的软骨损伤治疗方案尤为必要。

国外已有科研团队利用同种异体软骨修复软骨缺损,且取得了可喜的临床效果,我国尚无相关研究的报告。同种异体软骨移植来源广泛,且避免了供区并发症,可用于大面积软骨缺损的修复。其本身的免疫原性相对较低,当软骨细胞被细胞外基质包裹时,宿主免疫反应显著减低,提高了移植的成功率。然而,同种异体软骨移植也面临许多挑战。首先是免疫排斥反应,尽管细胞外基质为软骨细胞提供了免疫屏障,但移植后的软骨细胞仍可能引发宿主免疫应答反应,导致同种异体软骨移植物的功能减退或丧失。此外,不同年龄、性别、取材部位、储存方式等因素也影响着供体同种异体软骨的质量和匹配度,以及细胞外基质的完整性和软骨细胞的活力。尽管捐献者进行了严格的生物安全性检查,但同种异体软骨移植仍存在疾病传播的风险。另外,从供体捐献到后续处理、转运及体内植入等整个流程较为繁杂,这无疑增加了感染的风险,对整个医疗团队的技术水平和设备条件提出了更高的要求。

由于同种异体软骨移植后发生的免疫排斥缺乏典型临床症状,容易被临床医生忽视。尽管目前大多数研究者认为软骨具有先天的“免疫豁免”特性,植入体内前无需严格的主要组织相容性复合体(MHC)匹配,但相关的研究表明MHC匹配可显著改善长期预后,这也在一定程度上说明了重视同种异体软骨移植可能面临的免疫排斥风险是必要的。目前关于同种异体软骨移植免疫方面的认知偏差主要源于其低反应性容易引起人们的忽视,以及目前学术领域对其免疫机制理论研究的匮乏。因此,深入了解同种异体软骨移植的免疫反应特征,对提高其移植成功率至关重要。

同种异体软骨的免疫原性来源

免疫原性成分分析及发生机制      软骨细胞表面抗原主要包括Ⅰ类和Ⅱ类MHC抗原,以及可能存在的特异性分化抗原。Ⅰ类MHC抗原在软骨细胞中组成型表达,Ⅱ类MHC抗原则在特定条件下(如炎症或免疫激活)可被诱导表达。由于软骨细胞在生理状态下被细胞外基质包裹,避免了与免疫系统接触,所以同种异体软骨移植通常不会发生免疫排斥反应。当炎症、创伤等导致基质屏障破坏,或进行直接的软骨细胞移植时,其细胞表面抗原就会暴露在外,引发免疫排斥反应。免疫排斥风险主要由移植细胞与宿主免疫系统相互识别及作用引发。宿主体内的T细胞、B细胞以及NK细胞等免疫细胞可识别并攻击移植的软骨细胞。此外,移植过程中软骨细胞表面抗原的暴露程度、宿主的免疫状态以及移植部位的免疫微环境等因素也影响免疫排斥反应的发生和严重程度。

细胞外基质的免疫调节功能在同种异体软骨移植的免疫调节反应中也起着同样关键的作用。细胞外基质本身结构极其致密,能够保护软骨细胞表面抗原,同时有效隔离阻碍淋巴细胞、巨噬细胞等免疫效应细胞的浸润,降低免疫排斥反应的发生概率。细胞外基质本身的部分组分如高分子量透明质酸、转化生长因子-β1(TGF-β1)等也能够通过诱导巨噬细胞表型分化、抑制促炎因子分泌等方式调节局部免疫微环境,实现免疫耐受。然而,当创伤、炎症或酶解作用等导致细胞外基质降解时,释放的胶原片段、低分子量透明质酸等成分可引发固有免疫应答,导致免疫排斥反应的发生。研究表明,在同种异体软骨移植失败病例中经常发现其细胞外基质结构完整性破坏,导致淋巴细胞浸润和相应抗体生成,这也进一步提示了基质屏障完整是维持免疫豁免的关键要素。基于以上研究证据,未来的研究应着力明确细胞外基质成分与免疫细胞相互作用的分子机制。这也提醒研究者,在制备软骨脱细胞细胞外基质支架时,要在保留基质屏障完整性、免疫调节物质和尽可能去除细胞成分间进行平衡。

软骨组织的免疫豁免特性      ABO血型、Rh因子和人类白细胞抗原(HLA)匹配是大多数实体器官移植的基本要求,移植后需长期服用强效免疫抑制药物以防止免疫排斥反应的发生。软骨作为特殊的“免疫豁免”组织,其免疫隔离效应主要源于致密的细胞外基质形成的抗原隔离状态。因此,同种异体软骨移植术后患者通常不引发显著免疫反应,不需要术前检测及术后服用免疫抑制剂,这一现象与其免疫豁免特性密切相关,为临床应用该技术提供了重要理论依据。关于脱离细胞外基质保护的单独软骨细胞是否具有免疫原性,早期研究呈现矛盾结论。Chesterman和Smith在1968年的研究中未观察到移植后的免疫排斥现象,而Langer和Gross在1974年则报道了细胞和体液免疫反应。近年研究逐步揭示软骨细胞的免疫调节特性,Adkisson团队发现孤立软骨细胞不仅不能激活T细胞,反而可抑制已激活T细胞的增殖。其免疫豁免能力涉及多重机制:一方面,软骨细胞特异性表达具有免疫抑制功能的软骨调节素-I(ChM-I);另一方面,在干扰素-γ(IFN-γ)刺激下,软骨细胞可上调色氨酸2,3-双加氧酶(IDO),该酶通过介导色氨酸代谢途径诱导免疫耐受。这些发现为解析软骨细胞的免疫特性提供了新的分子依据。综上所述,软骨的免疫豁免特性由基质屏障与细胞固有调控双重维持,但其机制复杂性提示需深化研究以优化移植策略。

降低免疫原性的策略与技术

软骨片脱细胞化技术      降低免疫原性的常用策略是利用不同的去细胞技术去除产生免疫原性的细胞成分,以减少抗MHC抗体产生。如前所述,在去除细胞成分的同时,要尽量保持细胞外基质的完整性,以降低其内部成分暴露可能引发的巨噬细胞炎症反应以及针对纤维连接蛋白或胶原的抗体反应。目前文献报道中常用的脱细胞方法包括物理法、化学法(去垢剂、酶消化)以及生物法(核酸酶降解残留DNA)。同种异体软骨常用的物理脱细胞方法包括循环冻融法以及超临界二氧化碳法等技术。循环冻融法通过破坏软骨细胞膜实现脱细胞的目的,其优点是成本低,操作过程简单,且能够在有效去除细胞成分的同时保留细胞外基质生物活性成分和结构的完整性。但这种方法也存在因遗传物质去除不足而引发免疫排斥反应的劣势。另外,冻融过程也对软骨组织的天然结构存在一定程度的影响,降低其生物力学性能。超临界二氧化碳脱细胞技术具有高渗透性和高扩散性,能够深入软骨组织内部,高效去除细胞成分,且能最大程度保留细胞外基质生物活性成分和结构的完整性。但这种技术存在脱细胞后残留DNA较高的劣势,这无疑增加了免疫排斥的风险,需要改进相关参数或者结合其他脱细胞方法,以提升其脱细胞效率。

化学脱细胞法主要是利用酸、碱、醇类、螯合剂及表面活性剂等物质去除软骨细胞成分以降低其免疫原性。常用的酸类物质如过乙酸、乙酸等,能够通过化学反应破坏核酸物质、清除胞质成分,但也存在化学物质残留、破坏细胞外基质超微结构、降低力学性能的不足。氢氧化钠/钙等碱性物质通过破坏细胞膜并使DNA变性来实现脱细胞的目的,但是这种方法可能引起细胞外基质内部胶原纤维的降解和结构功能的改变。醇类物质通过脱水作用溶解细胞并清除脂质-核酸复合物,操作简单、成本低,但其脱水效应可改变细胞外基质胶原三维构象,导致生物力学性能下降。螯合剂通过竞争性地结合二价阳离子削弱细胞与细胞外基质的黏附性,实现脱细胞的目的,但是存在过度处理导致界面分离的风险。表面活性剂通过破坏细胞膜结构实现脱细胞效应,成本低、操作简单,但存在细胞外基质生物活性成分丢失,化学物质残留可能引发的细胞毒性或致癌效应等缺陷。基于此可以判断,化学脱细胞方法能够实现高效的脱细胞目的,但是脱细胞过程导致细胞外基质完整性破坏引起的免疫原性风险、细胞外基质结构破坏引起的力学性能下降,以及生物活性成分丢失和化学试剂残留等问题不容忽视,这也制约了其临床应用。

酶法脱细胞技术主要是利用生物酶的催化作用,特异性地清除细胞成分,实现脱细胞目的。目前最常用的两种脱细胞酶是核酸酶和脂酶。核酸酶通过水解磷酸二酯键降解细胞内的核酸物质,降低其免疫原性。但酶解时间过长存在细胞外基质蛋白水解、力学性能下降的风险。脂酶通过催化甘油酯及磷脂键断裂的方式清除细胞膜及脂质包裹成分,但可引起部分细胞外基质功能成分如糖胺聚糖等物质的非特异性流失。与化学脱细胞法相比,酶法脱细胞技术因其作用底物单一,能够更好地保护细胞外基质结构完整性,但其脱细胞效能受到酶的作用浓度、生物活性及反应动力学等因素的影响。此外,酶解产物的残留也可能会干扰后续软骨组织的功能重建。

残留DNA及细胞抗原的清除效能是评估脱细胞技术去除免疫原性的关键指标。循环冻融法面临细胞膜裂解不彻底及改变细胞外基质蛋白构象的缺点,可能导致核酸物质残留或暴露基质抗原,导致免疫原性反应增强。相比之下,超临界二氧化碳脱细胞技术可以通过调控相关参数实现超流体渗透,在维持细胞外基质三维拓扑结构的同时高效清除细胞碎片,显著降低宿主免疫识别的风险。化学脱细胞法与酶脱细胞法可有效清除遗传物质,降低免疫原性反应。但是这两种方法均可对软骨细胞外基质的超微结构造成一定损伤,引起潜在抗原表位的暴露,进而触发次级免疫反应。因此,理想的脱细胞技术需在脱细胞效率、细胞外基质生物活性物质保留、免疫原性物质去除等方面实现平衡。

免疫原性成分的检测与清除      既往其他研究证实受者体内的MHC抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)抗体是心脏移植术后发生早期排斥反应的主要因素。这给如何降低同种异体软骨移植免疫排斥风险带来一些思考。首先,对高风险受者,如有输血史、妊娠史或其他器官移植史的患者,进行术前特异性抗体筛查,有助于降低术后免疫排斥反应的发生概率。其次,可以利用血浆置换术、服用B淋巴细胞抑制剂等方法来降低免疫排斥反应的发生率。因此,移植术前应综合评估抗体特异性、供体匹配性以及患者的整体免疫状态。然而,当前的的临床共识表明同种异体软骨移植术后免疫排斥反应发生率极低,故术前检测及治疗的必要性仍需探讨。

免疫调控策略     在实体器官移植中,免疫抑制如环孢素、他克莫司、霉酚酸酯等药物通过抑制T细胞活化增殖来降低免疫排斥反应。但这些药物的应用可能引发术后感染、肾功能损伤,以及全身代谢紊乱等并发症。鉴于同种异体软骨移植免疫排斥反应的发生率低且临床表现轻,因此,目前不推荐术后常规使用免疫抑制剂。基质金属蛋白酶(MMPs)作为细胞外基质降解与重塑的关键物质,其生物活性对同种异体软骨移植的结果起着关键作用。研究者需要精确调控其生物活性,以免过度激活引发细胞外基质病理性降解,或者是活动降低导致局部免疫微环境紊乱。通过靶向调节MMPs与其内源性拮抗剂基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的活动水平,可以稳定软骨细胞外基质代谢,抑制炎症和免疫排斥反应,可激活内源性修复通路,增强软骨修复界面的整合,最终提升同种异体软骨修复效能。规律成簇的间隔短回文重复及相关蛋白(CRISPR-Cas)技术在骨关节炎治疗中的应用为同种异体软骨移植免疫调控提供了新的治疗思路。可以利用该技术编辑供体软骨细胞的MHCⅡ类抗原,靶向降低其免疫原性,从而抑制受体免疫系统识别,减少免疫排斥反应的发生风险。其次,通过敲除白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎症调控相关基因,可改善同种异体软骨免疫微环境,促进移植软骨存活及功能重建。另外,通过敲低MMP13基因的表达,能够抑制软骨基质的病理性降解,促进Ⅱ型胶原合成,维持细胞外基质稳态。然而,该技术存在脱靶效应、原代软骨细胞编辑效率不足及潜在的伦理争议等不足,限制了其临床应用。在未来的研究中,可通过优化编辑工具的特异性与安全性、开发高效的递送系统、建立完善的伦理监管体系,推动其临床转化应用。

未来方向

未来研究应致力于开发新的精准免疫调控技术以优化脱细胞工艺,在保留细胞外基质免疫调节功能的同时,彻底清除残留DNA和隐匿抗原物质。注重细胞外基质炎症反应及代谢稳态的平衡,抑制级联反应。优化基因编辑工具,开发针对软骨细胞MHCⅡ类抗原的CRISPR-Cas9特异性编辑系统,联合高效、低免疫原性载体实现基因递送。其次,供体组织质量的标准化制定与监测也非常关键,通过单细胞测序评估供体软骨免疫原性,开发质量控制平台,推动供体组织库的标准化建设。最后,免疫耐受微环境重塑也是未来重要的研究方向。通过设计负载免疫调节因子的细胞外基质支架,诱导巨噬细胞向抗炎表型极化,降低炎症反应。结合间充质干细胞共移植策略,利用其分泌的外泌体抑制T细胞活化,增强移植软骨的免疫耐受性,降低免疫排斥反应的发生概率。通过上述研究方向的突破,有望实现同种异体软骨移植的精准化、标准化与规模化临床应用,为关节软骨缺损修复提供更优解决方案。

结论

同种异体软骨移植作为一种治疗关节软骨缺损的重要手段,具有独特的优势,但其免疫原性问题仍是影响移植成功率的关键要素。本文系统分析了软骨的免疫原性来源,包括软骨细胞表面抗原、细胞外基质的免疫调节功能及其条件依赖性,同时探讨了脱细胞技术、免疫调控策略及基因编辑等降低免疫原性的方法。现有技术虽在一定程度上降低了免疫排斥反应,但供体组织质量标准化缺失、技术操作复杂性及次级免疫反应等问题仍未解决。未来研究应聚焦于优化脱细胞工艺、精准调控免疫微环境及基因编辑工具的临床转化,同时推动供体组织质量标准化建设,为关节软骨缺损修复提供更优解决方案。

来源：实用骨科杂志2025年6月第31卷第6期

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