作者：吴敬文，汪洋，高飞，黄杰等，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室

短串联重复序列（Short tandem repeats， STRs）是基因组中1~6 bp的重复DNA元件，广泛分布于编码区和非编码区［1］。人类基因组中有超过150万个STR位点，占基因组的6.77%，其重复区域长度在代际遗传中易发生扩展或收缩，导致动态突变［2］。STRs的扩张程度越大，临床症状越严重，发病年龄越早，当重复次数超过特定阈值时会产生病理作用，但致病机制和遗传风险各异。例如，脆性X综合征（Fragile X syndrome， FXS）相关的脆性X信使核糖核蛋白1（Fragile X messenger ribonucleoprotein 1， FMR1）基因5'UTR区域（CGG）n重复扩展长度可分为正常型（约30次重复）、中间型（45~54次重复）、前突变型（55~200次重复）和全突变型（>200次重复），不同类型伴随不同遗传风险，包括患脆性X相关震颤/共济失调综合征（Fragile X⁃associated tremor/ataxia syndrome， FXTAS）和脆性X相关原发性卵巢功能不全（Fragile X⁃associated primary ovarian insufficiency， FXPOI）的风险［3］。动态突变检测通过对STR区域的分析，检测重复次数、甲基化状态及其他变异（如插入、嵌合、缺失和点突变等），这些变异与疾病发病和临床表现密切相关。本文梳理了FXS类动态突变疾病的重要检测技术。

1 FXS类动态突变检测技术

1.1 核型分析

核型分析（Karyotyping）通过显微镜观察染色体数量、结构和形状，常用于诊断染色体异常的遗传疾病。在1991年FMR1基因被成功克隆前，核型分析是脆性X综合征（FXS）的唯一细胞遗传学诊断方法。通过观察X染色体长臂（Xq 27.3）的脆性位点FRAXA特征进行FXS诊断，该位点对叶酸敏感，因此在缺乏叶酸的培养条件下，可诱导FRAXA表达，导致X染色体长臂末端出现丝状断裂，形成脆性位点［4］。然而，该方法费时费力且并非所有细胞都能呈现脆性位点，现已不常用，但仍可用于排除其他染色体异常导致的卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency， POI）。

1.2 DNA印迹杂交

DNA印迹杂交法，即Southern blot法，是一种用于检测DNA中特定序列的方法，过去常用于诊断与动态突变相关的疾病。以FXS诊断为例，该方法通过限制性核酸内切酶切割基因组DNA，得到含目标STR区域的片段。然后使用标记探针与STR区域结合，检测重复区域的长度，从而分析重复次数。该方法可以区分FMR1基因的不同类型，并揭示启动子区域的甲基化状态。但其局限性在于无法精确量化重复数目，也不能识别插入、缺失和点突变，无法准确区分中间型与前突变型，不利于对前突变女性患FXPOI并发症的风险进行预测［5］。

1.3 三重重复引物PCR

三重重复引物PCR（Triple Repeat Primer PCR，TP⁃PCR）是一种基于PCR的分子诊断方法，常与毛细管电泳技术结合，用于定量检测STR区域的重复次数。以FXS诊断为例，针对FMR1基因5′UTR上的STR区域，设计三条引物：荧光标记下游引物、上游通用引物和一条5′端为通用引物、3′端包含（CGG）n结合序列的Repeat引物。Repeat引物的特殊设计使其能结合CGG重复区域的不同位置，产生多个连续片段大小的扩增产物。通过毛细管电泳技术，同时分析扩增产物和荧光标记的分子量标准品（70~1 200 bp片段混合物）的大小，并将两者比较，从而准确量化CGG重复次数，识别AGG插入。该方法常用于前突变女性产前筛查和预测患FXPOI并发症的风险，但不能检测缺失、点突变或甲基化状态等信息［6］。

1.4 甲基化特异性PCR

当FMR1基因5′UTR区域（CGG）n扩增到全突变时，常伴有启动子区域CpG岛甲基化，导致FMRP蛋白表达缺失。因此，需要对样本的甲基化状态进行特异性检测。甲基化特异性PCR（Methylation⁃Specific PCR， MS⁃PCR）技术通过亚硫酸盐转化将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。使用甲基化和非甲基化特异性引物分别扩增相应区域，判断甲基化状态［7］。该方法在FXS诊断中具有高灵敏度和特异性，在甲基化比例超过20%时，其诊断结果比Southern Blot更精确［8］，但该方法无法量化重复数目，一般只用于甲基化检测［9］，且对DNA的质量要求较高，质量差的样本可能会导致假阳性或假阴性结果。

1.5 甲基化特异性多重连接

依赖探针扩增甲基化特异性多重连接依赖探针扩增（Methylation⁃Specific⁃Multiplex Ligation⁃dependent Probe Amplification，  MS⁃MLPA）是一种分析DNA甲基化状态和拷贝数变异的技术。它通过两种反应：一种仅使用连接酶估计DNA拷贝数变异，另一种同时使用限制酶和连接酶检测甲基化状态，最终整合两者信息。在FXS诊断中，MS⁃MLPA不仅能检测FMR1基因启动子区域的甲基化状态，还能揭示女性个体不同X染色体间的甲基化差异。但当甲基化突变占比低于5%时，该方法检测稳定性较差，且无法检测基因内的倒位、易位或量化重复数目［10］。临床上，MS⁃PCR常用于FXS初步诊断，以评估甲基化状态，而MS⁃MLPA则能够提供更全面的变异信息，特别适用于复杂病例的精确诊断，但对女性患者X染色体失活的情况，可能无法完全揭示甲基化和重复扩展状态。

1.6 短读长测序技术

短读长测序技术（Short⁃read sequencing）通过酶切或物理方法将DNA切割成短片段，连接接头序列后进行PCR扩增，形成测序文库并加载到测序芯片上进行信号读取，最终转化为序列信息以识别变异。尽管该技术已广泛用于疾病检测，但在长STR扩增（如前突变、全突变）诊断中仍存在限制。例如，FXS相关的FMR1基因5'UTR （CGG）n重复区域因GC含量高和低复杂性，难以通过PCR扩增。长片段PCR虽可扩增该区域，但效率随重复扩展下降，可能产生假阳性结果。全基因组测序则可能误判完全扩增的重复为前突变，且有假阳性或假阴性风险［11］ 。此外，短读长测序无法直接检测基因甲基化修饰，而甲基化状态对于FXS诊断至关重要。由于（CGG）n  STR区域重复次数多，短读长测序片段较短，可能无法覆盖整个重复区域，导致后续比对错位或拼接错误。为提高比对准确性，需通过数据过滤、优化组装和比对工具，或采用特定算法改进结果。

1.7 光学基因组图谱技术

光学基因组图谱技术（Optical Genome Mapping， OGM）能识别大于500 bp的拷贝数变异（Copy Number Variation， CNV）和其他结构变异（如插入、倒位和易位）［12］。它通过荧光标记和长DNA分子分析，生成可视化的基因组图谱。目前，OGM已成功应用于STR扩增及体细胞变异的基因型分析［13⁃14］。

为了对FXS进行诊断，Bionano Genomics公司开发了基于OGM技术的EnFocus™ Fragile X工作流程，该流程通过限制性内切酶切割基因组DNA并标记切割位点，实现对DNA分子空间位置的可视化。随后，选择与FMR1基因座对齐的分子进行局部组装和基因组图谱构建，以分析CGG重复阵列及其两侧区域。结合对齐图谱和目的区域在X染色体上的区间坐标，利用贝叶斯概率模型估计样本中的CGG重复次数。研究表明［15］，该方法的预测性和分析灵敏度分别达到100%和97%。然而，其局限性在于无法精确解析结构变异的断点，也无法区分某些插入事件（如AGG插入）［16］。此外，当CGG重复次数接近200的阈值时，仅依赖该流程可能无法准确区分前突变和全突变，需结合其他技术进一步分析［17］，这一局限性可能影响前突变女性患者FXPOI并发症的早期筛查。

1.8 长读长测序技术

利用长片段PCR（Long⁃range PCR， LR⁃PCR）技术，结合长读长测序技术（Long⁃read sequencing）对串联重复区域进行检测可能是更全面表征重复区域的方案。长读长测序技术的代表性平台包括Pacific Biosciences（PacBio）的单分子实时测序技术（Single⁃molecule real⁃time sequencing， SMRT）和纳米孔测序技术（Oxford nanopore sequencing tech⁃nologies，ONT）［18］。

PacBio SMRT测序技术通过将DNA模板固定于零模波导孔（Zero⁃mode waveguide， ZMW）底部，利用DNA聚合酶合成新链时掺入荧光标记的核苷酸，实时检测荧光信号并转化为序列信息。该技术实现单分子长读长测序，避免PCR扩增误差，能准确检测重复区域和结构变异，已应用于动态突变检测。以FXS为例，该技术可诊断有扩增和无扩增的FMR1基因［19］。一项对62位患者的研究中，该技术成功量化重复序列（93⁃940），确诊30例全突变患者，识别中断和嵌合现象，并发现两名患者的罕见变异（237 kb和774 kb缺失）。研究表明，该技术检测灵敏度可达TP⁃PCR技术的2~4倍［20］，通过高灵敏度准确检测重复数目，有望用于前突变女性产前筛查和预测患FXPOI并发症的风险。

ONT的纳米孔测序技术通过电流变化识别DNA或RNA序列，适合长片段测序，能有效解析复杂重复序列，常用于动态突变检测［21］。其ReadUntil功能可靶向特定基因区域测序，而非全基因组测序，有潜力经济有效地测序致病性STR基因座，尽管尚未充分验证。为评估ReadUntil在STR分析中的应用，已有研究设计定制面板，覆盖与神经病理性疾病相关的致病性STR扩展基因，并进行靶向纳米孔测序。结果显示，该方法能在单一检测中并行基因分型，涵盖所有已知神经病理性STR位点。对于FXS诊断，可同时分析FMR1基因内STR区域的异常（CGG）n扩增和DNA甲基化状态，成功组装20~654个拷贝的CGG STR，与临床试验结果一致。此外，该技术还具备单次分析中解析DNA甲基化图谱的优势［22］，具有高效、高通量且不受样本数量限制的特点，可用于快速批量完成前突变女性的产前筛查，并预测其患FXPOI并发症的风险。

2 总结与展望

动态突变疾病由基因中重复序列的扩增或缩减引起，扩增程度不同导致不同病理表现，因此检测扩张区域对预测疾病至关重要。FXS的诊断需分析CGG重复数量、甲基化状态、嵌合现象及AGG中断，无大规模CGG重复的病例还需检测点突变、缺失或重复等。现有PCR和Southern blot技术难以检测缺失与点突变；二代短读长测序因读长限制，难以跨越长STR区域，可能导致比对错位或拼接错误，但可检测缺失、插入和点突变；OGM作为新兴技术，需结合其他技术区分前突变和完全突变；而三代长读长测序技术能在单次分析中提供更多信息，对疾病预测至关重要。随着成本降低，三代测序有望成为快速、准确和全面的诊断方法，逐步应用于临床。

参考文献略。

来源：吴敬文,汪洋,高飞,等.基因动态突变的检测进展[J].分子诊断与治疗杂志,2025,17(06):981-983+987.

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