作者：耿沫，胡韶山，浙江省人民医院·杭州医学院附属人民医院神经外科肿瘤中心

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是常见的原发性脑肿瘤中最恶性的形式，属于WHO Ⅳ级的星形细胞瘤，它恶性程度高、生长快、病程短，并且术后容易复发，具有很高的致残率。GBM的治疗主要以手术治疗为主，尽可能多地切除肿瘤，而GBM的边界不清，难以切除完全，因此可以放化疗为辅，目前最常用的化疗药物是替莫唑胺（temozolomide，TMZ），穿过血脑屏障的效率为15%～30%，可与进口药物联合使用，或与光动力疗法（photo dynamic therapy，PDT）联合治疗，增强GBM的治疗效果。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是GBM 的重要治疗靶点。最近的单细胞水平DNA测序技术证明了不同遗传亚克隆的共存，而单细胞RNA测序揭示了不同的转录组谱。然而，这种以肿瘤细胞为中心的观点可能低估了TME的作用，这只会导致治疗反应的渐进式改善。

GBM的微环境复杂，以髓系细胞、血管、星形胶质细胞和细胞外基质为代表，在不同的肿瘤区域存在差异。肿瘤肿块的很大一部分由免疫细胞组成。肿瘤相关髓系细胞（tumor-associated myeloid cell， TAMC）可占肿瘤体积的50%。TAMC 代表由树突状细胞（dendritic，DC）、中性粒细胞、骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophage，BMDM）、小胶质细胞和髓源性抑制细胞组成的异质性群体。此外，淋巴细胞也在TME中大量存在。

1.PDT对GBM免疫微环境的影响

PDT是一种新型的治疗方法，即利用激光、活性氧和光活性化合物（光敏剂）在光激活后诱导癌细胞和癌前细胞死亡。PDT还通过多种机制刺激抗GBM免疫：（1）位于内质网上的钙网蛋白通过PDT移动到细胞膜表面，并提供“吃掉我”的信号以引起免疫反应；（2）转录因子表达NF-κB、热休克蛋白70，上调或促进细胞因子分泌（IFN-γ、IFN-α）；（3）促进抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）和细胞毒性T细胞的突变归巢；（4）募集中性粒细胞杀死GBM 细胞，然后引起巨噬细胞浸润。

其中，PDT也可以引发免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），这是诱导免疫应答的最常用方法。PDT与放射治疗一样，有一个严重的缺点，需要氧气才能发挥作用。因此，PDT在低氧或由于光敏剂消耗分子氧而发生缺氧时，表现出较低的效率，导致PDT抵抗。当介质中的氧浓度不够高时，光损伤会减少，甚至根本不发生光动力反应。以后的研究中，对抗缺氧可能成为有效的PDT治疗癌症的必要条件，并可能使患者GBM治疗显著改善。目前，对PDT在GBM免疫微环境中的机制研究越来越多，这将有助于GBM的临床治疗。

2.PDT的影响因素

PDT的有效性及其细胞毒性也受到许多因素的影响，包括光敏剂的类型和光的剂量、氧气的存在以及暴露于光源的时间。针对GBM的理想光敏剂必须是具有全身无毒，富集于肿瘤组织，不在正常组织中积累，且不会对周围组织造成损害。不同的光敏剂所使用的激光照射波长也会有所不同。金丝桃素（hypercin，HYP）是一种新型的天然光敏剂，是从贯叶金丝桃中提取的一种天然物质，通常选择更具穿透力的590 nm黄光照射。

HYP是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的调节剂之一，在无光照条件下也可以诱导肿瘤细胞凋亡。随着科技的进步，光敏剂的研究和应用仍有更广阔的发展空间。HPPH是焦磷-α的2-（1-己氧基乙基）-2-羟基衍生物，代表了已经在多种肿瘤中进行临床试验的第二代光敏剂。基于HPPH的第三代光敏剂的演变涉及多模式应用的结构修饰和多功能化合物的组合，从而改善成像定位并具有卓越的抗肿瘤效果。HPPH具有良好的光动力活性，理想的作用光谱及准确的靶向性，基本不需要避光，用量小，使用方便，是一种极富市场潜力的光敏剂。其他光敏剂如血卟啉衍生物，5-氨基酮戊酸、亚甲基蓝、和与各种物质交联的酞菁类等均可用于PDT治疗。

3.PDT肿瘤靶向治疗对免疫细胞的作用

1）巨噬细胞相关免疫治疗机制　

巨噬细胞（macrophage，M0）是最重要的先天性免疫细胞，其极化可获得两种表型：M1抗肿瘤群体和M2 促肿瘤群体。各种外部因素可能会影响极化，这意味着三种表型（M0、M1和M2）可以在肿瘤微环境中共存。在TME中，M1或M2亚型分别代表肿瘤抑制或肿瘤支持性巨噬细胞。部分研究表明，PDT照射肿瘤细胞可促使M1极化，缺氧和肿瘤内乳酸的产生可促使M2极化。

虽然在GBM基质中发现了不同的表型，但M2表型占主导地位，优先定位于缺氧区域，而M0和M1表型主要存在于常氧区域。PDT体外处理的巨噬细胞产生TNF-α，该细胞因子对GBM细胞的细胞毒性作用被证实是PDT抗肿瘤作用的相关机制。此外，与PDT处理的GBM细胞共同孵育的未经处理的巨噬细胞也可以被诱导产生TNF-α。

在这种情况下，损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），例如由PDT处理的细胞表达的热休克蛋白70，可以触发由Toll 样受体2 和4（TLR2 和TLR4）介导的巨噬细胞中的信号通路，从而导致调节NF-κB信号的TNF-α生成。胶质母细胞瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞（glioblastoma associated macrophage，GAM）由两个群体组成分别为骨髓来源的巨噬细胞（以下简称巨噬细胞）和大脑驻留小胶质细胞（以下简称小胶质细胞），它们分别来源于骨髓和胚胎卵黄囊中的祖细胞，共同发挥着相似的吞噬作用。

TP53突变在人GBM中很常见，除了对细胞循环和细胞凋亡的影响外，突变体p53的肿瘤表达通过激活人GBM细胞（如U87和19NS）中的NF-κβ信号转导来增加CCL2和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达。反过来，增加的CCL2和TNF-α 可以将巨噬细胞和小胶质细胞募集到GBM 的TME中。缺乏NRP-1的小胶质细胞群或外周巨噬细胞群也能够抑制GBM的进展。在这种情况下，全面了解 PDT诱导的巨噬细胞活化机制及其在GBM治疗反应中的作用仍然至关重要。

2）T淋巴细胞相关免疫治疗机制　

T 细胞衰竭是免疫抑制TME 中的一个突出特征，在阻碍GBM免疫治疗中起着关键作用。具体来说，TME表现出对CD8+T细胞的选择性排斥，并同时抑制其细胞毒性活性，最终导致CD8+T 细胞在TME内浸润不足，从而促进免疫逃避。PDT后体内也有大量T 细胞的积累。虽然CD4+T 细胞和CD8+T细胞均增加，但在治疗后7 d，CD4+T细胞数量超过CD8+T细胞，结果提示PDT可增强适应性免疫。

GBM 抗肿瘤免疫杀伤作用是由细胞毒性CD8+T细胞和辅助性CD4+T细胞同执行的。这些调节性T细胞（Tregs）是免疫抑制细胞的主要群体，它们在免疫逃逸过程中通过分泌TGF-β、IL-10和IL-35来抑制CD8+和CD4+T细胞介导的免疫功能。同时，它们可以通过产生颗粒酶和穿孔素直接杀死T细胞。

当Tregs主导肿瘤的免疫功能时，就会发生免疫逃逸，PDT治疗后消除了外周Tregs的抑制能力，但对Tregs水平没有影响。许多研究表明，强烈的PDT会导致免疫抑制分子（如PD-1、CTLA-4 和IDO）上调，从而介导免疫逃避。因此，PDT与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）（如抗PD-1/PD-L1 抗体）联合阻断PD-1/PD-L1 通路或IDO 抑制剂调节GBM 免疫微环境可能是增强PDT诱导的免疫力用于癌症治疗的潜在方法。

有研究评估了ALAS2、ITGA10和ADAM12基因表达与免疫细胞浸润的相关性，发现ALAS2、ADAM12、ITGA10与不同类型的T细胞呈正相关或负相关，但与B 细胞无相关性。因此，靶向调控ALAS2、ADAM12和ITGA10可能成为增强PDT联合抗PD抗GBM作用的新途径。ICD被认为是实现完全GBM细胞消除的最有希望的方法之一。它激活T细胞适应性免疫反应，并导致长期免疫记忆的形成。ICD 可由多种抗癌治疗方式触发，包括PDT。但是PDT存在着局限性，由于GBM免疫微环境的缺氧，导致PDT 诱导ICD 的效率并不高，因此，最近几年的研究显示，也可以通过改善光敏剂，采用第三代纳米光敏剂技术靶向诱导ICD。

3）DC细胞相关免疫治疗机制　

目前可用的免疫疗法中，DC疫苗的开发已经投入了巨大的努力。PDT处理的GBM细胞裂解物（PDT-DC疫苗）已用于小鼠模型中针对肿瘤的免疫治疗。PDT-DC疫苗接种诱导了有效的肿瘤特异性CTL 反应，并有效刺激CD8+T 细胞分泌IFN-γ。PDT诱导的GBM细胞凋亡比冻融处理的坏死GBM细胞更能增强DC的成熟，从而提高PDT-DC疫苗的临床应用。

DC是先天免疫反应和适应性免疫反应之间的主要联系，是专业的APC，在所有机体组织中数量较少，专门负责抗原的摄取、运输、加工和向T细胞呈递。RNA-seq分析表明，PDT 后接受ICD的神经胶质瘤细胞在DC疫苗中诱导了典型的Th17特征，这在保护小鼠免受胶质瘤侵害方面非常有效。

通过使用基于 ICD 和 光敏剂-PDT 的 DC疫苗诱导 Th17 免疫并使用该预后模型预测神经胶质瘤患者的总体存活率来改善神经胶质瘤患者的总生存期开辟了希望的途径。PDT处理的凋亡GBM细胞诱导DC的表型成熟，包括MHC Ⅱ类和共刺激CD80和CD86分子的上调。这些分子的表达高于冻融肿瘤细胞诱导的表达。相关研究还评估了某些细胞因子的模式，包括IFN-γ、IL-12和IL-10的分泌，发现PDT处理的DC表现出以IFN-γ为特征的显著功能激活模式。

一种名为OR141的新型非卟啉光敏剂可以诱导ICD，从而在光动力激活时促进抗癌免疫反应。这种形式的细胞死亡是由OR141对内质网的高趋向性引起的，导致诱导主要的ER应激反应，蛋白酶体去泛素化酶的失活进一步加剧。OR141 有在白光LED 激活时诱导DAMPs的能力，同时可以杀死GBM细胞（从而释放抗原），这使得在重新注射疫苗接种之前使用此类光敏剂介导的PDT来攻击DC更有效果。

4）中性粒细胞相关免疫治疗机制　

最近的一项研究揭示了一种新的现象，即TME中的中性粒细胞自发地发生铁死亡，这一过程释放出限制T细胞活性的氧化脂质。铁死亡是指一种新发现的RCD机制，由细胞膜的铁依赖性脂质过氧化介导，具有独特的形态、生化和遗传特征。中性粒细胞可能在PDT治疗的GBM中发挥多方面的作用。

例如，它们可能诱导GBM细胞毒性和参与抗GBM免疫反应，前者是由中性粒细胞激活后从中性粒细胞内的储存颗粒中释放出的潜在损伤酶驱动的，而后者是由中性粒细胞通过分泌趋化因子和通过表达MHC Ⅱ类分子来引导免疫细胞所致。PDT诱导强烈的急性期炎症反应，其特征是C反应蛋白、甘露糖结合凝集素和血清淀粉样蛋白P水平升高。这些蛋白在促进中性粒细胞的募集和激活方面起着至关重要的作用，从而增强肿瘤微环境中的整体免疫应答。所以对于GBM的治疗，如果使用改善炎症的药物作为光敏剂可能是一种有效的治疗方法。

来源：耿沫,胡韶山.胶质母细胞瘤的光动力治疗与免疫微环境的基础研究进展[J].中国激光医学杂志,2024,33(05):286-291.DOI:10.13480/j.issn1003-9430.2024.0286.

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