导读

慢性肾脏病（CKD）的患病率正不断上升，影响着全球超10%的人口。继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）是CKD多种并发症之一，由维生素D缺乏和高磷血症引起，会导致代谢性骨病（CKD-MBD）和血管钙化（VC），进而增加心血管疾病甚至死亡风险。

多项报道表明，大多数CKD患者存在肠道微生物紊乱，即肠道菌群失调。相关研究提示，使用益生菌治疗CKD大鼠可改善CKD大鼠肠道微生物群数量和肠道屏障蛋白，并降低血清尿毒症毒素水平。基于此，该研究旨在使用一种由唾液乳杆菌、长双歧杆菌、壳寡糖（COS）和菊粉组成的合生制剂，通过调节肠道微生物群和促进肠道屏障功能来抑制肠道磷吸收，从而治疗慢性肾脏病高磷血症和甲状旁腺功能亢进症。

研究背景

改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）工作组曾针对CKD合并SHPT的诊疗方案召开讨论会议，并于2017年制定了SHPT管理指南，考虑到血管钙化风险，KDIGO指南建议限制使用钙基或活性维生素D治疗甲状旁腺功能亢进，以调节血钙水平并减缓VC的进展。因此，非钙磷结合剂、钙敏感受体激动剂以及新型药物如柠檬酸铁和tenapanor被引入临床。

CKD中高磷血症的病因众多，包括肠道磷吸收增加、骨转换和肾脏磷吸收。大多数传统干预措施仅仅旨在减少肠道磷吸收，如限制饮食中的磷摄入和使用磷结合剂。而钙敏感受体激动剂、维生素D和甲状旁腺切除术则旨在抑制血清甲状旁腺激素水平。最近研究表明，在正常至高磷情况下，细胞旁路转运是磷进入细胞的主要途径，使用钠/氢交换抑制剂调节细胞旁路转运可以有效降低人体血清磷水平。

大多数CKD患者由于多种因素存在肠道菌群失调。肠道菌群失调通过下调上皮紧密连接蛋白导致肠道屏障泄漏，增加细胞旁路转运，进而引发高磷血症。肠道微生物组的改变还会促进尿毒症毒素、内毒素、炎症和细菌易位，从而加速肾脏疾病的进展。通过食物或生物干预改善肠道菌群失调有望减缓CKD的进展。

研究方法

研究者对CKD组大鼠腹腔注射顺铂（8mg/kg）以诱导慢性肾脏病（CKD），正常对照组大鼠则注射生理盐水。注射诱导后，随机将大鼠分为四组（每组n=8）：（1）正常对照组，（2）CKD对照组，（3）CKD组使用干酪乳杆菌作为标准益生菌治疗（STDPro），（4）CKD组使用由壳寡糖（COS）、菊粉、长双歧杆菌BFS309株和唾液乳杆菌LBR228株组成的合生制剂治疗（Synbiotics）。每两周测量一次大鼠体重和饮水量。在第0周（顺铂诱导肾损伤后2周）、第4周、第8周和第12周，采集大鼠血液，进行血清生化分析、组织病理学评估、紧密连接蛋白表达分析以及粪便微生物组分析。

研究结果

【大鼠健康状况】

在整个研究期间持续监测大鼠的一般健康状况。每4周记录各组大鼠体重。CKD诱导期后，正常对照组大鼠的体重略高于所有CKD组，但实验期间的体重差异无统计学意义。所有组大鼠的食量和饮水量相当，未观察到显著差异。

【血清生化和尿毒症毒素水平】

-顺铂诱导肾损伤后2周，CKD各组大鼠血清肌酐水平较正常对照组均显著升高（P<0.05），并持续升高至实验结束（图1a）。各CKD组间血肌酐水平无显著差异。

-在整个实验过程中，与正常对照组相比，所有CKD组大鼠血磷水平均显著升高 （P<0.05）。第0周时，CKD STDPro组和CKD Synbiotics组大鼠的血清磷酸盐水平正常，但在第8周和第12周时逐渐升高。实验结束时，与CKD STDPro组相比，CKD Synbiotics组大鼠的血清肌酐显著降低（降低约29.04%，P < 0.05），与正常对照组相当（图1b）。

-第12周时各组血清钙水平无显著差异 (图1c)。

-研究结束时，与CKD对照组相比，CKD Synbiotics组大鼠的钙磷乘积 (Ca×P) 显著降低 (图1d，P < 0.05)。

-研究结束时，与CKD对照组相比，CKD Synbiotics组大鼠PTH水平同样显著降低，并与正常对照组大鼠相当（图1e，P<0.05）。

-此外，CKD Synbiotics组大鼠血清尿毒症毒素硫酸吲哚酚水平显著低于CKD对照组大鼠，并在实验结束时与正常对照组大鼠相当 (图1f，P<0.05)。

图1 .大鼠血清生化水平

(a)第0周至第12周的血清肌酐水平。(b) 第4周至第12周的血清磷酸盐水平。(c) 第12周血清钙水平。(d) 第12周血清钙磷乘积。(e) 第12周血清甲状旁腺激素 (PTH) 水平和 (f) 第1周血清硫酸吲哚酚水平。数据表示为平均值±SD，*P < 0.05。

【病理组织学检查】

所有顺铂诱导的大鼠肾脏均存在明显的组织病理学变化，包括肾小管坏死、肾小球坏死和多发性肾小管扩张等。CKD对照组、CKD STDPro组和CKD Synbiotics组的肾小球病变评分未提示显著差异。

-各组Occludin（OCLN）表达水平无统计学差异 (图2a)。

-与正常对照组相比，CKD对照组ZO-1（紧密链接蛋白相关基因）表达显著下降（P<0.05)，CKD Synbiotics组ZO-1表达增加至与正常对照组水平相当 (图2b)。

-空肠免疫组化分析显示，与 CKD对照组相比，CKD Synbiotics组 ZO-1 表达显著增加（图2c，P<0.05)。

图2 .紧密连接蛋白标记物在大鼠空肠上皮组织中的表达情况

(a)qRT-PCR法测定 occludin 基因 (OCLN) 的 RNA 表达。将相对表达水平归一化为管家基因，表示为平均值±SD。(b) 通过 qRT-PCR 测定闭锁小带-1(ZO-1) 基因的 RNA 表达。将相对表达水平归一化为管家基因，表示为平均值±SD。和(c) 使用组织学评分系统评价空肠上皮组织中 ZO-1 蛋白的免疫组织化学染色。评分基于上皮紧密连接处抗 ZO-1 抗体阳性染色面积的百分比。当阳性染色面积＜10%时记为0分，10-25%记为1分，26-50%记为2分，51-75%记为3分，＞75%阳性染色记为4分。数据以箱形图显示，显示 Min-Max 评分和中位数。*p < 0.05。

【肠道菌群分析】

实验结束时进行大鼠肠道菌群分析，评估各实验组微生物群落的多样性。Shannon’s、Faith’sPD和Pielou指数分析表明，各组间肠道菌群均无显著差异，表明各组大鼠微生物多样性和均匀度相似（图3）。

图3.分析各实验组粪便菌群的相对丰度

(a)Shannon多样性指数，(b)Faith系统发育多样性 (PD)，(c)Pielou均匀度，(d) 门水平的相对丰度和 (e) 属水平的相对丰度。箱须图以中位数±IQR表示，须线代表最小值和最大值。

研究结论

研究团队认为益生菌/合生制剂是缓解CKD大鼠慢性肾脏病高磷血症和甲状旁腺功能亢进症并发症严重程度的关键，由唾液乳杆菌LBR228、长芽孢杆菌BFS309、FOS和 COS 组成的合生制剂，通过调节肠道菌群和改善紧密连接蛋白表达可有效降低CKD大鼠的血清磷酸盐、钙磷乘积和PTH水平，进一步降低骨矿盐疾病和血管钙化的风险。该研究首次证实合生制剂可有效改善CKD动物血清磷酸盐水平和甲状旁腺，这种新型合生制剂有望作为治疗高磷血症和SHPT的辅助疗法。

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