作者：许志华，张勉，空军军医大学第三附属医院
颞下颌关节(temporomandibular joint， TMJ)同样是OA好发部位，其发病受多种因素调控，机制复杂。目前颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis， TMJ OA)的治疗主要是保守治疗，虽一定程度上可以缓解症状，但髁突软骨的退行性变无法彻底逆转。鉴于软骨中异常钙化在包括TMJ OA在内的众多OA发病中的重要作用，本文总结了当前OA，特别是TMJ OA中软骨异常钙化的研究进展，为后续的治疗研究提供参考。
1. OA软骨钙化
目前研究发现终末期OA患者软骨内均有明显钙化，且软骨钙化程度与OA组织学分级存在显著正相关性。虽然OA的病因及病理机制机尚不完全清楚，但
1.1 OA软骨钙化的表现
1.1.1 OA软骨钙化大体表现
正常关节软骨通常呈蓝白色，表面光滑湿润，富有光泽，按压有弹性。OA初期关节软骨呈淡黄色，表面粗糙，白色光泽消失，呈局灶性退变。在OA早期，受光学显微镜分辨率的限制，通常不能发现非钙化软骨层内的异常钙化，而只能显示钙化软骨层的增厚，在OA晚期，随着软骨内异常钙化的加重，大体形态上可清晰观察到退变软骨内散在分布的白色点状或线状的钙化晶体沉积。
1.1.2 OA软骨钙化的影像学表现
OA软骨内的异常钙化在X线平片上主要表现为关节间隙内散在分布颗粒状、斑片状等不规则高密度影像，有时呈细线样平行于骨关节面，二者存在1～2 mm的透明间隙。
1.2 OA钙化晶体类型
OA的临床症状与异常钙化程度之间存在密切联系，关节内有钙化晶体的OA患者比没有明显晶体沉积的患者的临床症状更严重，进展速度更快，且关节积液更多。而随着OA进展，患者关节滑液中逐渐可检测到钙化晶体，因此OA关节滑液是研究相对早期OA软骨内钙化晶体类型的主要来源。
碱性磷酸钙(basic calcium phosphate， BCP)晶体和二水焦磷酸钙(calcium pyrophosphate dehydrate， CPPD)晶体是OA关节中两种最常见的异常钙化晶体，常在各个阶段的OA患者的滑液中发现，同时研究也发现滑液中有BCP晶体或CPPD晶体的OA患者，其OA的影像学评分更高。纳入研究的所有膝关节OA患者中， 47%滑膜液中含有BCP晶体， 32%含有CPPD晶体，使用
2. TMJ OA软骨钙化的表现和影响
2.1 TMJ OA软骨钙化的表现
TMJ OA是颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders， TMD)中的一种退行性病变，临床上可表现为耳前区疼痛、关节杂音以及下颌运动障碍等。流行病学研究显示， TMJ OA发病率为8%～35%，约占TMD的8%～16%。
影像学检查对TMJ OA的诊断、治疗及预后均具有重要意义。研究表明TMJ OA关节软骨异常钙化的X线检查结果与关节软骨的病变严重程度、病变范围以及所使用的X线检查方法有关：一方面X线检查本身具有一定的局限性，并不总能准确的反映关节处的真实病变，另一方面受TMJ属于小关节这一解剖因素限制， TMJ OA软骨异常钙化在普通X线检查中常不能被准确观察，大多仅表现为CBCT中骨皮质线上方散在分布的高密度影像。
同样受解剖因素和临床样本来源的限制， TMJ软骨异常钙化在大体形态亦难有明显的特征性变化，常表现为散在的白色反光点状和线状晶体合集。髁突软骨细胞自表面至深层依次分为纤维层、增殖层、前肥大层、肥大层及钙化软骨层，利用透射电子显微镜(transmission electron microscope， TEM)则可发现单侧前牙反(unilateral anterior crossbite， UAC)大鼠TMJ OA髁突软骨中非钙化软骨层(特别是纤维层及增殖层等浅层软骨)的异常钙化表现，一般呈现局部点状钙化，与之相对的是，钙化软骨层的异常钙化呈现出片状钙化。
正畸诱导大鼠TMJ OA模型中也观察到类似现象，髁突软骨形态的组织学观察中发现髁突软骨中后部存在局部点状或块状钙化，TEM观察结果显示TMJ OA软骨钙化在超微结构上表现为点状或团块状的钙化晶体局部沉积。
2.2 TMJ OA软骨中钙化晶体类型及其影响
鉴于TMJ关节体积较小，患者体内软骨钙化的发生在大体不易观察、影像学检查易较难发现的问题，利用动物构建TMJ OA模型成为研究TMJ OA软骨异常钙化的主要方法。在UAC诱导的TMJ OA大鼠体内观察到髁突软骨内BCP样矿物质的大量沉积，而在TMJ OA患者钙化关节盘中亦可检测到羟基磷灰石晶体沉积，提示与外周关节类似，碱性磷酸钙(BCP)晶体可能是TMJ OA异常钙化的主要钙沉积。
钙化晶体可直接加剧异常关节负荷引起的关节损伤。钙晶体与软骨细胞、细胞外基质等之间的刚度差异可能导致晶体诱导的软骨细胞机械转导失调，诱导下颌骨髁突软骨细胞出现OA表型。骨软骨界面可以阻止软骨与软骨下骨的物质交换，在TMJ OA中，UAC刺激大鼠下颌骨髁突软骨深层逐渐钙化，下颌骨髁突骨软骨界面的厚度、密度和硬度显著增加，其力学性能变差，持续的异常载荷下，硬化界面出现裂纹，导致髁突软骨、软骨下骨交换增加，促进骨重塑以及髁突软骨退行性改变。
钙化晶体还可通过促进软骨细胞炎症因子的表达进而促进TMJ OA的进展。BCP晶体和焦磷酸钙二水化合物(CPPD)晶体均可诱导髁突软骨细胞表达白细胞介素- 1(interleukin- 1， IL- 1)、肿瘤坏死因子- α(tumor necrosis factor- α，TNF- α)等炎症因子， IL- 1、 TNF- α是参与TMJ OA进展的主要促炎因子，可单独或协同其他分子诱发炎症。 IL- 1、 TNF- α一方面可抑制软骨细胞合成代谢活动进而下调软骨基质的合成，另一方面可促进软骨细胞释放MMPs、 ADMTS等基质降解因子促进软骨基质的降解，加速TMJ OA软骨退行性改变。此外， BCP晶体和二水焦磷酸钙(CPPD)晶体可直接上调软骨细胞MMPs、ADMTS、RNS的表达，进一步诱导软骨基质降解、促进软骨细胞凋亡，加重TMJ OA软骨退行性变。
3. TMJ OA关节软骨异常钙化的可能机制
目前对于TMJ OA关节软骨异常钙化的具体机制尚未完全明确，但是在机体内组织钙化的调控受到众多分子的调控，各种抗钙化分子和促钙化分子之间的表达平衡对于防止组织发生异常钙化发挥了重要作用。同时，近年来的研究也发现各种细胞外囊泡也积极参与了TMJ OA软骨异常钙化的发生。
3.1 抗钙化分子的减少
基质羧基
研究证实过表达MGP可以显著抑制体外矿物质形成，抑制MGP表达会导致小鼠骨生长障碍并诱导动脉血管壁以及软骨的异位钙化，用剪切应力刺激人OA软骨细胞可降低MGP mRNA的表达。而在UAC诱导的大鼠TMJ OA软骨中，实验组大鼠髁突软骨细胞MGP的表达显著下调。
胎球蛋白A(Fetuin- A)：Fetuin- A广泛存在于血液循环和骨骼中，是一种多功能蛋白，可抑制骨形成蛋白和TGF- β的功能，其N端胱抑素1结构域具有很强的钙离子结合能力。Fetuin- A、 MGP与钙和磷酸盐组成更易溶解的钙蛋白复合物，可有效抑制钙盐的异常沉积。在退行性关节疾病中，血清中Fetuin- A水平下降，可导致异常钙沉积和骨赘的形成。OA患者血清中Fetuin- A水平低于健康个体，且与临床严重程度呈负相关， TMJ OA患者血清中Fetuin- A的含量也低于健康个体水平。
胞外 5’端核苷酸酶(CD73)：CD73催化ATP、AMP转化为腺苷酸，腺苷酸可抑制组织非特异性碱性磷酸酶(tissue- nonspecific alkaline phosphatase， TNAP)活性， TNAP通过水解焦磷酸根离子(pyrophosphate， PPi)产生磷酸盐(phosphate， Pi)促进BCP晶体的形成， CD73通过抑制TNAP的活性间接抑制钙盐晶体的形成。在UAC诱导的大鼠TMJ OA模型中， CD73在髁突软骨内的表达显著下降。
3.2 促钙化分子增多
TNAP： PPi可有效抑羟基磷灰石的形成，促进CPPD晶体的合成。TNAP催化PPi和其他磷酸盐类化合物的水解生成Pi从而促进BCP晶体的合成。有研究证实小鼠缺乏TNAP基因会导致细胞外PPi浓度升高和骨骼矿化不良，进而抑制羟基磷灰石晶体的形成和生长，而在大鼠TMJ OA髁突软骨中， TNAP的表达显著上调。
基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase- 13， MMP- 13)：基质金属蛋白酶可以降解细胞外基质，其中MMP13在OA中起主要作用。过大的异常生物力可诱导OA，此时软骨细胞高度表达MMP13， MMP13可水解软骨基质中的胶原成分，暴露胶原纤维上的钙离子结合位点，从而促进退行性软骨基质中的矿物沉积。在大鼠TMJ OA髁突软骨中，MMP13的表达显著上调，且具有明显的时间依赖性。
转化生长因子β(transforming growth factor- β， TGF- β)： TGF- β能显著上调关节软骨内PPi浓度，促进软骨细胞形成与分泌细胞外囊泡，加速软骨中CPPD晶体异常钙化沉积，同时TGF- β还可促进软骨细胞分泌MMP13，加速软骨基质的降解，促进OA软骨退变。在小鼠膝关节OA模型中，异常负荷可导致破骨细胞活动增加，进而诱导TGF- β的高表达，促进OA软骨异常钙化和退变，而在OA患者软骨下骨中TGF- β含量也显著上升。
在成骨细胞特异性突变TGF- β1小鼠中， TGF- β在骨髓中的表达升高，促使下颌骨髁突发生退行性改变，同样在TMJ OA大鼠模型中也观察到下颌骨髁突软骨以及软骨下骨中TGF- β信号被异常激活，而抑制TGF- β1受体可缓解大鼠TMJ OA的发展。
核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase- 1， NPP1)：NPP1可将ATP转变为PPi， 细胞外过量的PPi与钙离子结合形成碱性磷酸钙前体，最终形成CPPD晶体。有研究显示NPP1表达上调可导致CPPD晶体形成促进软骨异常钙化。此外，过量的PPi促进软骨细胞凋亡，可能引发OA的发生。在TMJ OA大鼠髁突软骨中，NPP1的表达也显著上调。
3.3 细胞囊泡
细胞囊泡是一组异质性的细胞源性膜结构，根据大小来源不同分为外泌体(直径40～200 nm或30～150 nm)、微囊泡(直径200～1 000 nm或100～1 000 nm)和凋亡小体(500～2 000 nm或50～5 000 nm)3 种形式。大量研究表明不同生理状态的细胞分泌不同表征的细胞囊泡，参与多种生理、病理过程，而异常钙化与相关细胞囊泡密切相关。
3.3.1 LC3+分泌性自噬体
自噬属于非常规的分泌过程，称为分泌性自噬，可将碱性磷酸钙前体(ACP)从功能失调的线粒体转移到自噬体中。自噬体标记物LC3在分泌性自噬途径中，介导细胞内蛋白、 RNA等物质在细胞外囊泡的装载和分泌。研究发现LC3+分泌性自噬体能够诱导TMJ OA软骨异常钙化，是钙化细胞囊泡的主要群体。大鼠TMJ OA模型中， OA早期即发生软骨钙化，TEM观察到钙化区域出现沿胶原纤维排列的球形细胞囊泡样颗粒。
元素分析结果显示TMJ OA软骨细胞中的LC3+自噬体内含有以钙磷为主的无定形矿物质，同时在OA状态下组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6， HDAC6)表达增强，诱导α微管蛋白去乙酰化，导致α微管蛋白含量减少和微管功能失衡，而软骨细胞内微管功能破坏则可导致LC3+自噬体与溶酶体的融合发生障碍，从而使LC3+自噬体向胞外分泌形成LC3+分泌性自噬体，而此类自噬体在细胞外基质中大量聚集启动了TMJ OA软骨的异常钙化，形成退变软骨中的钙化团块。
3.3.2 外泌体
外泌体具有不同的细胞亚型，在正常和病理状态下的细胞间通讯中发挥着重要作用。OA患者滑膜成纤维细胞产生的外泌体可促进巨噬细胞产生IL- 1等一系列趋化因子及促炎因子，进而导致关节软骨破坏和局部炎症。外泌体不仅引起OA炎症变化，还可促进TMJ OA软骨异常钙化。TANP将软骨基质中的PPi水解为Pi， 位于外泌体膜上的钠依赖性磷酸盐转运体PiT- 1将Pi转运至外泌体内，Ca2+通过膜连蛋白A5进入外泌体，二者结合形成ACP，同时外泌体内膜上的磷脂酰
在TMJ OA大鼠中的研究发现，外泌体更可能是通过其内部的蛋白质或酶发挥诱导TMJ OA软骨异常钙化的作用，异常生物力刺激促进TMJ软骨细胞形成并大量分泌外泌体，此时的外泌体中MGP等抗钙化分子的含量显著降低，但NPP1和TNAP等促钙化分子的含量显著上调，进而在细胞外的软骨基质中发挥促进钙盐沉积的作用。而对TMJ OA大鼠髁突软骨细胞的外泌体形成进行抑制，则可以显著降低TMJ OA大鼠髁突软骨中的异常钙化和退变程度。
3.3.3 凋亡小体
软骨细胞凋亡在生理性钙化以及OA发展中发挥重要作用。当软骨发生降解时，软骨细胞通过内外两种途径释放凋亡小体参与OA软骨的钙化。凋亡软骨细胞释放的凋亡小体具有TNAP活性，能够促进产生Pi并浓缩Ca2+形成ACP，在体外表现出与外泌体相似的促钙化能力。
体外实验表明磷脂酰丝氨酸与Ca2+及Pi结合形成复合物促进羟基磷灰石沉积，位于凋亡小体外膜的磷脂酰丝氨酸可触发巨噬细胞清除凋亡小体，然而OA软骨中缺乏血管及巨噬细胞，导致凋亡小体在关节软骨基质中积累，凋亡小体释放ACP， ACP沉积在胶原原纤维上形成BCP晶体。在人和小鼠OA中，与健康软骨相比，OA软骨中的软骨细胞凋亡增加，且凋亡与软骨损伤的严重性呈正相关，对人膝关节OA软骨的研究显示软骨细胞凋亡和BCP晶体共定位。目前在TMJ OA大鼠模型中，异常生物力学刺激可触发软骨细胞内质网途径的凋亡机制已经被证实。
4. 结论与展望
TMJ OA发病机制复杂，异常钙化是其重要特征之一，钙化晶体与TMJ OA的发病和进展密切相关。目前研究已经表明钙化晶体可能通过增加软骨细胞炎症介质的释放、上调MMPs的表达、加重氧化应激损伤、诱导软骨细胞凋亡、基质降解等促进OA的发生与发展。因此，明确TMJ OA软骨异常钙化的分子机制，早发现或早阻断其钙化过程，可能为治疗TMJ OA提供新的潜在治疗靶点。
来源：许志华,张勉.颞下颌关节骨关节炎中软骨异常钙化的研究进展[J].实用口腔医学杂志,2024,40(04):568-573.
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