作者：程兰兰，冯宗刚，马丽影，谭丽等，郑州大学第二附属医院生殖医学部

卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）是指将精子直接注射入卵母细胞质内的辅助受精显微操作技术，是目前治疗男性不育的主要手段。ICSI在严重少、弱、畸精子症以及经皮附睾穿刺取精（PESA ）和睾丸穿刺取精（TESA）的梗阻性无精子症方面得到了广泛应用。既往研究认为，实验室操作技术及女性因素是影响 ICSI 助孕结局的主要因素。而不同来源精子对 ICSI 助孕结局的影响尚无定论。本文对接受 ICSI治疗的临床病例进行分析，探讨不同来源精子对助孕结局的影响，现报道如下。

1  资料与方法

1.1    研究对象与分组    选取2015年1月至2017年3月在郑州大学第二附属医院生殖中心接受ICSI助孕治疗、女方年龄20~40岁的584个取卵移植周期。本中心ICSI指征：（1）严重的少、弱、畸精子症。（2）不可逆的梗阻性无精子症。（3）生精功能障碍（排除遗传缺陷疾病所致）。（4）免疫性不育。 （5）体外受精（IVF）失败。（6）精子顶体异常。（7）需行植入前胚胎遗传学检查者。（8）前次IVF受精率低于30%或多精受精比例较高、没有获得足够可移植胚胎者。排除标准：（1）男女双方任一方染色体异常。（2）女方子宫畸形、子宫内膜异位症或输卵管积水。（3）卵巢反应不良，获卵数＜3枚。
1.2    研究方法
1.2.1    促排卵及取卵    所有患者均采用我中心标准长方案进行促排卵。于月经前一周期的黄体期开始用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，达必佳）0.1mg/d皮下注射7d后降至0.05 mg/d，直至hCG日。当达到降调标准［子宫内膜厚度≤5mm，卵泡刺激素（FSH）＜5U/L，雌二醇（E2）＜180pmol/L，黄体生成激素（LH）＜5U/L］则根据患者自身情况开始启动促性腺激素促排卵，行内分泌检查及阴道超声监测卵泡发育，2~3个主导卵泡直径发育至18mm以上当日注射hCG 10kU后36h于超声引导下经阴道后穹窿穿刺取卵。
1.2.2    卵母细胞处理    取卵后将卵母细胞置培养箱内培养2~4 h，用透明质酸酶去除卵母细胞周围的颗粒细胞，选取MⅡ卵行ICSI。
1.2.3    精液精子的处理    取精前禁欲 2~7d，取卵日男方采用手淫法取精，密度梯度离心法处理精液样本，将处理好的样本置于37℃培养箱待行ICSI。
1.2.4    PESA取精及精子处理    取卵日，患者取平卧位，常规消毒铺巾，采用精索阻止麻醉，麻醉成功后，用5mL注射器接针头，预先吸入Quinn's 1020约1mL，经皮垂直进入附睾内，反复抽吸数次，带负压拔出注射器，将混合液注入培养皿，在显微镜下寻找可利用精子，处理后置于37℃培养箱待行ICSI。
1.2.5    TESA取精及精子处理    患者准备及麻醉方法同上，固定穿刺侧睾丸，用穿刺针从待穿部位经皮垂直刺入睾丸，将所取出的曲细精管置于培养皿中，镜下研磨曲细精管，寻找可利用精子，直接离心制备成精子悬液，置于 37 ℃培养箱待行ICSI。
1.2.6    供精精液精子处理    对符合供精指征的患者，其供精精液于37℃水浴复温后，梯度离心。
1.2.7    受精、卵裂及胚胎移植    行ICSI后 16~18h，观察卵子受精情况，出现两原核卵子为正常受精卵，取卵后第3天选择评分最高的1~3个胚胎进行移植，并给予常规黄体支持。
1.3    评价指标    临床妊娠率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率和流产率、累计妊娠率［（新鲜移植的妊娠数+截止到2017-07-31新鲜移植后未孕有冻胚复苏的妊娠数）/ 2015年1月至2017年3月新鲜取卵周期数］，以比较不同来源精子ICSI治疗后的结局。优质胚胎判定标准：来源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎细胞数为7~9个，碎片小于10%的胚胎。
1.4    统计学分析    采用 SPSS 21.0 统计软件进行分析，定性资料用百分率表示，采用卡方检验或Fisher精确法进行统计学分析，定量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，非正态分布采用秩和检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2  结果

2.1    患者基本资料    根据精子来源不同分为射精组（392个周期）、PESA 组（86个周期）、TESA组（68个周期）、供精组（38个周期，为精子解冻处理后活精密度＜3×109/L者）。射精组、PESA组、TESA组在女方年龄、男方年龄、不孕年限、女方体重指数方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。 
2.2    各组实验室指标的比较    射精组受精率高于PESA组（P=0.013）和TESA组（P=0.005）；射精组卵裂率高于TESA组（P=0.001），差异均有统计学意义。3组间MⅡ卵数和移植胚胎数、优质胚胎率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3    各组助孕结局比较    3组新鲜移植周期胚胎种植率、临床妊娠率、流产率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；TESA组累计妊娠率低于PESA组（P=0.003）。见表3、4。

2.4    射精组与供精组一般情况与实验室指标及助孕结局比较    两组间患者的一般情况、受精率、卵裂率、新鲜移植周期胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、累计妊娠率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

3  讨论

ICSI技术的发展给越来越多的不育男性带来了福音。ICSI技术直接将精子注入卵母细胞质内，因此对精子数量、活力要求极低。睾丸曲细精管是精子形成的场所，精子在睾丸中已完成了减数分裂，成为已携带父源遗传物质的单倍体和受精卵形成纺锤体所必需的父源中心粒，父源效应会影响受精、胚胎发育和最终的临床妊娠。精子在附睾内经过精核的进一步成熟，获得运动、识别卵子透明带以及与卵子结合的能力。

严重少、弱精子症及梗阻性无精子症患者均可通过ICSI技术生育后代，而不同来源的精子对ICSI助孕结局是否有影响，国内外尚无定论。本文结果显示，射精组的受精率高于PESA组和TESA组，卵裂率高于TESA组，原因可能是：睾丸穿刺取到的精子成熟度低，浓度和活力差，畸形率高，核浓缩不完全，染色体异常比例增加。睾丸穿刺精子还有少量碎的生精小管组织，睾丸精子有时需在体外培养一段时间后才具有活力，且大部分为微动精子，ICSI时选精及操作较困难，且卵子在体外暴露时间长，因此对受精率和卵裂率有一定的影响。但本文结果显示，各组间的优质胚胎率差异无统计学意义，说明PESA、TESA组即使受精率略低，仍可获得比较满意的优质胚胎。这与大多数文献报道一致。

胚胎种植率及妊娠率是反映移植胚胎在体内发育潜能的重要指标。本文结果显示，TESA组的新鲜移植周期胚胎种植率、临床妊娠率、分娩率偏低，但是差异无统计学意义。Naru等研究显示，射精组、PESA组、TESA组临床妊娠率分别为41.4%、43.5%和36.2%，差异无统计学意义，提示TESA组并未影响ICSI的助孕结局。但从具体数据上不难看出，TESA组的临床妊娠率低于射精组和PESA组，可能是由于TESA组的周期少，数据有限。Pasqualotto等研究结果显示，从附睾获得的精子比睾丸精子的妊娠率高（31.76% vs. 22.66%），流产率低（11.11% vs. 44.11%）。另外，PESA组的累计妊娠率高于TESA组，可能还与睾丸穿刺的精子成熟度偏低有关；而新鲜及冻胚移植的临床妊娠率各组间无明显差异，且优质胚胎率也相似。因此，对于梗阻性无精子症患者来说，PESA可获得较好的实验室指标及助孕结局。由于本文PESA、TESA例数偏少，尚需要积累更多的数据来观察附睾、睾丸精子对ICSI结局的影响。

关于供精行ICSI治疗对妊娠结局的报道比较少见。供精来源于精子库，对冷冻前的精液质量要求较高。有研究表明，即使严重少、弱精子症患者冻融精子后也并不影响ICSI的助孕结局。本中心仅对解冻后精液密度＜3×109/L者行ICSI治疗，结果显示，供精组和射精组可获得相似的实验室指标及助孕结局，原因可能为虽然精子冷冻复苏可增加精子DNA的损伤，使精子胞浆空泡增多、 细胞核和胞质膜皱缩或肿胀、膜断裂、顶体受损等，但冷冻也间接起到了一种筛选的作用，清除了大部分有缺陷的精子，但只有活力好、代谢旺盛的精子才能够耐受冷冻复苏过程。因此，即使冷冻复苏的精子，行ICSI后并不会影响其助孕结局。

综上所述，供精精子、严重少弱精子症患者射出精子、附睾来源的精子及睾丸精子行ICSI，均可获得相似的胚胎种植率和临床妊娠率。因此，在进行ICSI治疗时，需根据患者自身情况，选择创伤小、花费少，同时获得足够的优质精子的方法获得精子。对于梗阻性无精症患者来说，PESA确实是一种有效的获取精子的方法；有研究表明，不同来源冻融睾丸和附睾精子行ICSI治疗可以获得与新鲜附睾及睾丸精子相似的助孕结局。因此，开展冷冻附睾和睾丸穿刺获取的精子也十分必要，既可以确保取卵日有可用的精子，又可以减轻患者再次手术取精的创伤和痛苦，从而保存男性的生育力。

由于本研究纳入周期数少，可能结果存在偏倚，以后需要更多的临床数据进一步分析及随访，为临床提供更加可靠的依据。

参考文献略。

来源：程兰兰，冯宗刚，马丽影，谭丽等，不同来源精子对卵胞浆内单精子显微注射助孕结局影响研究[J],中国实用妇科与产科杂志,2018,9:1042-1046.