作者：王栋，潍坊市人民医院

一个“古老”的对手

结核病（tuberculosis，TB），这个与人类纠缠了数千年的“白色瘟疫”，至今仍是全球最致命的传染病之一。世界卫生组织（WHO）发布的《2024年全球结核病报告》显示，2023年全球新发结核病患者约1080万例，死亡约125万例，结核病再次成为单一病原体致死的首要病因［1］。

中国是全球结核病高负担国家之一，2023年新发病例约74.1万例，位居全球第三［1］。更令人担忧的是，耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）的防控形势日趋严峻——2023年全球MDR/RR-TB患者约40万例，而中国占比超过10%［1］。

结核病的诊断，一直是检验医学领域的一块“硬骨头”。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）生长缓慢（其结构如图1所示），传统培养需要2-8周才能出结果，涂片抗酸染色的灵敏度又不够理想。

一个患者从出现症状到确诊，往往要等上数周甚至数月，这段时间里，病原体可能在体内持续扩散，也可能已经传染给了身边的密切接触者。因此，时间就是结核病诊断中最稀缺的资源。而分子诊断技术的飞速发展，正在从根本上改变这一困局——将结核病的诊断时间从“周”缩短到“小时”，甚至“分钟”。

传统诊断方法：为什么“不够用”？

在分子诊断技术登场之前，结核病的实验室诊断主要依赖以下几种方法：

1.涂片抗酸染色

这是最传统、最经济的结核病筛查方法。将痰液标本涂片后进行萋-尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色或金胺O荧光染色，在显微镜下寻找抗酸杆菌。操作简单、成本低廉、出结果快，是基层医疗机构的首选筛查手段。

但它的局限性也很明显：灵敏度低，菌量需达到5000-10000条/mL才能检出［2］；无法区分MTB和非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）；对肺外结核的诊断价值有限。简单来说，涂片阴性不能排除结核病，涂片阳性也不能直接确诊为结核病。

2.分枝杆菌培养

培养是结核病诊断的“金标准”。固体培养（罗氏培养基）需2-8周，液体培养可缩短至1-3周。培养阳性不仅可以确诊结核病，还能进行药物敏感性试验（drug susceptibility testing，DST），指导临床用药。

然而，培养周期太长，远不能满足早期诊断的需求。而且培养条件苛刻，标本采集、运输、前处理任何一个环节出问题，都可能导致培养失败。

3.结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）

TST通过皮内注射纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD），48-72小时后观察硬结大小来判断是否感染MTB。但TST无法区分MTB潜伏感染和NTM感染（因为PPD中含有多种分枝杆菌的共同抗原），卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）接种也会导致假阳性，灵敏度受免疫状态影响大。

4.γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA）

IGRA通过检测致敏T细胞在MTB特异性抗原（ESAT-6和CFP-10）刺激下释放的γ-干扰素，来判断是否存在MTB感染。相比TST，IGRA的特异性更高，不受BCG接种和大多数NTM感染的干扰，是目前辅助诊断MTB潜伏感染的重要免疫学手段。

但IGRA同样存在局限——它只能回答“有没有感染”，不能回答“有没有活动性结核病”，也不能区分潜伏感染和活动性结核病。

传统方法的共同困境是：要么太慢（培养），要么不够准（涂片、TST），要么信息量有限（IGRA）。临床上需要一种既快又准、还能同时提供耐药信息的诊断工具。分子诊断，正是在这样的需求下走上前台的。

分子诊断技术：从“大海捞针”到“精准锁定”

分子诊断技术的核心逻辑并不复杂——直接检测MTB的核酸，而不是等细菌慢慢长出来。只要标本里存在MTB的遗传物质，就有可能被检测到。这就好比传统培养是“守株待兔”，而分子诊断是“主动出击”。

目前，结核病分子诊断技术已经形成了从核酸扩增到基因测序的完整技术谱系。

（一）实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

qPCR是结核病分子诊断的“元老级”技术［3］。其原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号实时监测扩增产物的积累，实现对MTB核酸的定量检测。

优点：qPCR将结核病的诊断时间从数周缩短至数小时，灵敏度显著高于涂片染色，且可同时检测NTM。

局限性：无法提供耐药信息，对标本中抑制物的耐受性有限，检测下限通常在100-1000拷贝/mL。

临床意义：将结核病诊断时间从数周缩短至数小时，尤其提升了菌阴肺结核和肺外结核的检出率。

（二）恒温扩增技术

恒温扩增技术是近年来在结核病诊断领域异军突起的一类方法。与qPCR需要精密的热循环仪不同，恒温扩增在单一温度下即可完成核酸扩增，对设备要求更低，更适合基层医疗机构。

1.环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP利用4-6条特异性引物识别靶基因的6-8个区域，在60-65℃恒温条件下60-90分钟即可完成扩增。反应产物可通过肉眼观察浊度或荧光信号判断结果。

TB-LAMP（Loopamp MTBC Detection Kit）已被WHO推荐用于结核病诊断，尤其适用于资源有限地区。研究显示，TB-LAMP对肺结核的灵敏度约为77%（95%CI：71%-83%），特异性约为99%（95%CI：97%-99.5%），在涂片阴性标本中的灵敏度仍可达40%-50%［4］，需要注意的是，恒温扩增技术对标本处理要求高，易因痰液粘稠、抑制物残留而出现假阴性，实际应用中需特别注意核酸提取质量。

2.交叉引物恒温扩增（cross priming amplification，CPA）

CPA是另一种恒温扩增技术，原理与LAMP类似但引物设计策略不同。国内已有多款基于CPA的MTB核酸检测试剂盒获批上市，操作简便，不需要复杂的仪器设备。

3.重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification，RAA）

RAA利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在37-42℃恒温条件下实现核酸快速扩增，20分钟即可完成反应。RAA技术灵敏度高、反应速度快，在结核病快速筛查中展现出良好的应用前景。

恒温扩增技术的共同优势是：设备要求低、操作简便、出结果快，特别适合基层和现场筛查。但需要注意的是，在操作不规范、引物设计不佳时，非特异性扩增风险相对较高，需严格质控。

（三）GeneXpert MTB/RIF及Xpert Ultra——分子诊断的“标杆”

原理：GeneXpert采用实时荧光定量PCR技术，以MTB的rpoB基因为靶标。rpoB基因编码RNA聚合酶β亚基，利福平的耐药机制主要与rpoB基因81 bp的利福平耐药决定区（rifampicin resistance-determining region，RRDR）突变有关。

GeneXpert在检测MTB的同时，通过分子信标探针检测rpoB基因RRDR区域的突变，从而同时判断是否对利福平耐药［5］。Ultra版加大了扩增体积并优化靶标，检测下限从约112 CFU/mL降低至约16 CFU/mL（痰标本中MTB的检测下限），对涂片阴性标本的灵敏度提升至约70%［6］。

优点：高度自动化（防污染）；2小时出结果；灵敏度极高（Ultra检测下限降至16 CFU/mL，大幅提升涂阴检出率）；利福平耐药检测特异度高（约98%）。

局限性：仅能提供利福平单药耐药信息；仪器及试剂成本相对较高。

临床意义：结核病分子诊断“标杆”。快速确诊同时筛查利福平耐药，作为MDR-TB（耐多药结核）的“哨兵”，指导临床第一时间启动耐药结核规范化治疗。

（四）线性探针杂交技术（line probe assay，LPA）

LPA是另一种被WHO推荐的分枝杆菌菌种鉴定和耐药检测技术。其原理是：先对标本或培养物中的核酸进行PCR扩增，然后将扩增产物与固定在尼龙膜条上的特异性寡核苷酸探针进行杂交，通过显色反应判断结果。

两种主要应用场景：

1.菌种鉴定（GenoType Mycobacterium CM/AS）

可同时鉴定MTB复合群和多种NTM，对MTB复合群的鉴定准确率超过99%，对常见NTM的鉴定准确率也在90%以上［7］。

2.耐药检测（GenoType MTBDRplus/MTBDRsl）

MTBDRplus：检测rpoB基因（利福平耐药）和katG基因及inhA基因启动子区（异烟肼耐药），覆盖了超过95%的利福平耐药突变和80%-90%的异烟肼耐药突变［8］。

MTBDRsl：检测氟喹诺酮类（gyrA/gyrB基因）、氨基糖苷类（rrs基因）和乙硫异烟胺（inhA基因启动子区）的耐药相关突变，用于广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的辅助诊断。

优点：可同时提供菌种鉴定和多药耐药信息；检测通量高；成本低于GeneXpert。

局限性：操作步骤繁琐（提取、扩增、杂交、显色）；对实验室技术能力要求高；直接痰标本灵敏度偏低，不推荐直接用于低菌量标本检测，主要适用于培养阳性或高菌量标本。

临床意义：用于MTB与多种NTM的精准菌种鉴定，以及MDR-TB（异烟肼+利福平）和XDR-TB（广泛耐药）的辅助诊断。

（五）熔解曲线分析技术（MeltPro）

MeltPro是国内自主研发的一种基于实时荧光PCR熔解曲线分析的分子诊断技术。其原理是：在PCR扩增后，通过缓慢升温使双链DNA逐步解链，利用荧光信号的变化生成熔解曲线，根据熔解温度（Tm值）的差异来区分野生型和突变型。

优点：闭管操作污染风险低；速度快（约3小时）；单管覆盖多位点多种突变；对中国流行耐药突变谱覆盖率高。

局限性：依赖已知突变位点设计探针，对罕见或未知突变可能漏检。

临床意义：国产自主研发技术的代表，适用于直接痰标本或培养物，快速检测MTB及利福平/异烟肼耐药和NTM鉴定，高度契合中国本土流行株特征。

（六）宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）

mNGS是近年来在感染病诊断领域最受关注的技术之一［9］。其原理是对临床标本中的全部核酸进行无偏倚测序，通过比对数据库来鉴定标本中可能存在的病原体。

优点：无偏倚筛查，可发现未知或罕见病原体；能同时检测混合感染（细菌、真菌、病毒）；对低菌量标本敏感。

对于常规检测阴性的疑难肺结核，mNGS可以提供额外的诊断信息。研究显示，mNGS对肺结核的诊断灵敏度约为60%-80%，特异性约为85%-95%［10］。

局限性：成本高昂；宿主核酸干扰大，临床标本需严格去宿主处理，否则会降低病原体检出率；检测周期长（24-48小时）；生信分析要求高；缺乏统一标准化和判读标准。

临床意义：作为常规检测阴性时的疑难肺结核/肺外结核（如结核性脑膜炎）的重要补充诊断手段，并有助于免疫抑制患者混合感染的全面评估。

通过对上述六种分子诊断技术的核心特征与应用价值进行对比分析，现将各技术要点整理如表1所示：

临床应用场景：什么情况下该用什么方法？

了解了各种分子诊断技术的原理和性能，接下来的关键问题是：在临床实践中，如何合理选择和组合这些检测手段？

场景一：疑似肺结核的快速筛查

推荐策略：首选Xpert MTB/RIF或Xpert Ultra。

对于疑似肺结核患者，Xpert Ultra应作为初始诊断的首选分子检测方法。它能在2小时内同时回答两个关键问题——“是不是结核病？”和“对利福平耐不耐药？”如果Xpert Ultra阴性但临床仍高度怀疑结核病，可进一步送检mNGS或tNGS，或重复送检标本。

场景二：涂片阴性肺结核的辅助诊断

推荐策略：Xpert Ultra+培养联合策略。

涂片阴性肺结核的诊断一直是临床难点。Xpert Ultra对涂片阴性标本的灵敏度显著高于原始版Xpert，但仍存在漏检可能。建议Xpert Ultra与分枝杆菌培养联合应用——Xpert Ultra提供快速结果，培养提供“金标准”确诊和后续药敏试验的基础。

场景三：耐药结核病的快速诊断

推荐策略：Xpert MTB/RIF（利福平耐药初筛）→ LPA或MeltPro（多药耐药确认）→ tNGS/WGS（全面耐药图谱）。

利福平耐药是MDR-TB的信号。Xpert MTB/RIF一旦检出利福平耐药，应立即启动MDR-TB的规范化诊疗流程，同时送检LPA或MeltPro进行异烟肼耐药确认。对于二线药物耐药的检测，可进一步采用MTBDRsl或tNGS。

场景四：肺外结核的诊断

推荐策略：mNGS或tNGS+病理+免疫学联合诊断。

肺外结核（如结核性脑膜炎、骨关节结核、腹腔结核等）的标本往往菌量极低，传统涂片和培养阳性率低，常规PCR灵敏度也不理想。mNGS和tNGS在肺外结核诊断中具有独特优势，建议与病理学检查（抗酸染色、肉芽肿病变）和免疫学检测（IGRA、ADA等）联合应用，综合判断。

场景五：NTM感染的鉴定

推荐策略：LPA（菌种鉴定）或MeltPro NTM+质谱鉴定（MALDI-TOF MS）。

NTM病的临床表现与结核病相似，但治疗方案完全不同，准确鉴定菌种至关重要。LPA和MeltPro NTM可对临床常见NTM进行快速鉴定，培养阳性后可进一步通过MALDI-TOF MS或16S rRNA测序确认。

总结

从1882年罗伯特·科赫发现结核分枝杆菌，到今天分子诊断技术将诊断时间从“周”压缩到“小时”，结核病实验室诊断走过了一条漫长的技术进化之路。但这场“人菌之战”远未结束——耐药结核病的蔓延、潜伏感染的庞大基数、诊断资源的不均衡分布，都是摆在我们面前的现实挑战。

对于检验人来说，理解每一种分子诊断技术的原理、性能和适用场景，合理选择和组合检测手段，让每一位结核病患者都能在最短的时间内获得准确诊断和有效治疗，这不仅是一份技术工作，更是一份责任。毕竟，在结核病的诊断中，时间就是生命。而分子诊断，正在为我们赢得这场与时间的赛跑。

专业审核：黄一芳（广西医科大学第一附属医院）

参考文献略。

来源：数智检验医学