MP实验室检测方法主要包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测，不同方法各有优缺点。

MP分离培养耗时长、特异性不高，临床实验室已较少常规开展。目前主要采用MP特异性抗原、抗体和聚合酶链反应（PCR）检测MP 。

近年来，环介导等温扩增（LAMP）、成簇规律间隔短回文重复序列/关联蛋白（CRISPR/Cas）技术、纳米生物传感器等新型检测方法在MP诊断领域取得显著进展，给临床提供了更多选择。

01MP分离培养

MP分离培养是目前鉴别MP的“金标准”。MP分离培养耗时较长，通常需1周才能完成。此外，该方法易受样本中杂菌污染，且检测灵敏度较低，一般不推荐作为常规检测方法。

尽管如此，MP培养在MP致病机制研究、疫苗研发等方面仍具有不可替代的作用；同时，基于临床样本的MP培养、鉴定和体外药物敏感性试验结果，可为临床诊疗提供可靠依据。

02免疫学检测

MP不同免疫学检测方法优缺点见表1。

1.抗原检测

MP抗原检测常用的检测方法有直接免疫荧光法（DIFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析法（ICA）等。

DIFA操作相对简便，数小时内即可完成检测，但灵敏度较低，且依赖荧光显微镜和专业人员的判读，对样本质量要求较高，目前已较少使用。

ELISA操作简便，适合批量检测，但需注意抗体产生的时间窗口和个体差异，在MP感染的诊断中，通常作为辅助，而非独立依据。

ICA凭借快速和便携的优势，在基层医疗机构和现场检测中应用广泛。

MP抗原检测的主要劣势包括：敏感性偏低、易与其他呼吸道病原体产生交叉反应等问题，导致其整体诊断效能尚不能完全满足临床需求，难以作为单一可靠的诊断依据。

2.抗体检测

MP抗体检测通过识别人感染病原体后产生的特异性抗体（主要为IgM、IgA和IgG）来诊断相关感染。其检测方法经历了从补体结合试验（CFT）、颗粒凝集试验（PA）至ELISA、化学发光免疫分析（CLIA）等技术迭代，检测效能持续提升。

MP IgM抗体通常在感染后1周左右可被检出，在第3~4周达到峰值，可作为近期感染的血清学指标，但因存在窗口期，感染早期会出现假阴性结果。

MP IgA抗体通常在感染早期迅速升高，其动态变化与MP IgM抗体基本一致。

MP IgG抗体出现较晚，约在感染后2周才可被检出，5周时达到峰值，且维持时间较长。MP IgG抗体阳性通常提示既往感染，单独检测的诊断价值有限，多用于流行病学调查。

3.酶联免疫斑点试验（ELISpot）

ELISpot是一种能够在单细胞水平高灵敏度检测抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）的方法，如 Mp-IgM-ASC（MP特异性IgM抗体分泌细胞）检测。

该方法的核心是检测外周血B细胞在体外经抗原刺激分化为浆细胞后分泌的抗体（如IgM），主要特点为：1）ASC在感染2 d时即可检出，早于血清抗体（IgM通常需1周）；2）ASC反应持续时间短（高峰在感染12 d左右），有助于区分活动性感染和既往感染/携带状态。

然而，该技术也具有局限性：1）敏感性较低，可检测的ASC数量有限，尤其是低龄儿童或免疫低下者，可能出现假阴性结果；2）技术要求高，需分离新鲜外周血单个核细胞（PBMC），操作复杂且标准化困难；3）临床推广受限，目前多用于研究，尚未作为常规检测方法推广。

03分子生物学检测

分子生物学检测方法凭借高特异性、高灵敏度、相对快速的特点在临床上广泛运用。核酸扩增技术包括DNA扩增和RNA扩增，检测性能较高，正逐渐成为临床诊断MP感染新的“金标准”。

1.MP DNA检测方法

MP DNA检测技术较为成熟且标准化程度高，但MP DNA可在体内长期残留，易出现“假阳性”结果。

实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是目前临床检测MP的首选方法。与常规RT-qPCR相比，RT-qPCR具有更高的灵敏度和特异性，检测速度更快，且具有支持高通量和自动化分析的优势。

多重PCR可同时检测MP和其他常见呼吸道病原体，显著提升了检测效率，尤其适用于混合感染或病因不明的呼吸道疾病。但复杂的引物设计和较高的检测成本仍是限制多重PCR在临床广泛应用的主要因素。

LAMP作为一种新型核酸等温扩增方法，操作简便、无需复杂设备、快速高效且成本低，备受关注。LAMP技术也存在一定局限性：其引物设计复杂，需要至少针对6个特定区域设计4条引物，这在一定程度上增加了假阳性结果的风险；同时，LAMP反应易受交叉污染影响，可能影响检测的准确性。

数字液滴PCR是一种核酸分子绝对定量技术，在临床中展现出早期诊断、动态监测和用药指导三大优势。与RT-qPCR相比，数字液滴PCR能够直接计数DNA分子数，实现对起始样本的绝对定量。通过定量监测临床样本中的MP载量，数字液滴PCR可帮助临床更准确地对疾病的进展和疗效进行评估。

2.RNA检测方法

RNA检测技术通过靶向MP的mRNA或rRNA，克服了DNA检测中“死菌残留导致假阳性”的问题。常见的方法包括RT-qPCR、LAMP、核酸序列依赖扩增（NASBA）和同步扩增检测（SAT）。其主要特点为：

1）靶标选择，主要检测mRNA（如mpn140、mpn456）或16S rRNA，可反映病原体活跃转录状态；

2）高时效性，mRNA半衰期短（数分钟至数小时），阳性结果强烈提示当前存在活动性感染；

3）耐药监测潜力，可结合耐药相关mRNA（如23S rRNA突变）实时评估抗菌药物敏感性。

3. 基因测序

宏基因组下一代测序（mNGS）是近年来发展起来的一种DNA/RNA测序方法，具有灵敏度高、检测面广、无偏向性等优势。然而，能检测样本中所有的微生物也使得该方法难以区分致病菌和定植菌，导致结果解释存在主观性。另外，mNGS检测成本显著高于常规方法。

靶向下一代测序（tNGS）是一种通过特异性探针或引物富集目标序列后进行DNA/RNA测序的方法，具有针对性强、灵敏度高、背景干扰弱、可同时检测DNA和RNA类病原体等优势。尽管tNGS在鉴定新发和罕见病原体方面无法完全替代mNGS，但临床肺部感染涉及的主要病原体多为常见类型，而这些病原体可通过tNGS实现有效检测。

纳米孔测序技术（NST）是一种通过检测病原体核酸分子穿过纳米孔时引起的电流变化来实现序列读取的第三代测序技术。NST无需PCR扩增，可直接测序，能快速获取病原体的完整基因组信息，具有长读长、强实时性、高便携性等优势，是MP等病原体快速鉴定、分型和耐药基因检测的全新方法，尤其适用POCT和流行病学溯源。

04其他新型检测技术

1.基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术

CRISPR/Cas作为一种新型基因编辑方法，因其经济高效、易设计和特异性识别快速而备受关注。

该技术具有便携、快速、低成本、高灵敏度和高特异性等优势，可为基层医疗机构提供更多的MP检测方法，但该技术在临床广泛应用仍需解决一些关键问题，如Cas蛋白的脱靶效应、crRNA设计的优化规则、检测通量和信号读取方式的优化。

基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术在MP检测方面的应用见表2。

2.增强拉曼光谱技术（SERS）

SERS是一种无标记、强有力的振动光谱技术，可增强吸附在金、银或磁性二氧化硅纳米管等离子体表面的分子的拉曼散射信号。

有研究发现，银纳米棒阵列表面增强拉曼光谱生物传感平台能够通过检测MP细胞中的特异性蛋白、氨基酸和核酸成分，有效区分MP及其P1亚型，以及其他12种人类共生和致病支原体；该方法不需要通过PCR或培养进行扩增，具有快速和灵敏的特性。

然而，银纳米棒阵列表面增强拉曼光谱技术目前尚无标准操作流程和完整的光谱库，其在复杂样本中的定量能力和检测的可重复性有待进一步提升，因此尚未开始临床应用。

3.生物传感器

基于微流体的生物传感器：为应对传统检测方法耗时长、成本高、操作复杂和样本需求较大等问题，微流控芯片技术集多个检测步骤于一体，实现了检测过程的自动化和一体化；其封闭式自动化管理和多微通道的特性，使检测过程既能减少污染，又具备高通量优势。该技术快速、准确、通量高，可满足当前病原菌检测对短时间、低成本、高便携性和高灵敏度的迫切需求。

然而，微流控生物传感器仍面临诸多挑战，如提升传感器稳定性、增强灵敏度、实现集成和小型化、大规模生产和降低成本、增强临时场景应用效果。

纳米生物传感器：纳米技术传感器具有纳米材料尺寸小、表体比大、表面可利用活性位点丰富、良好的信号传导和电导率等优点，既可作为识别元件，又可作为信号元件，有效提升了生物传感器的检测性能，并实现对病原体的灵敏快速测定。该技术设备简易、操作简便，尤其适用于资源有限地区。

电化学生物传感器：电化学生物传感器是一类选择性结合目标分析物并产生与待测物质浓度成比例电信号的生物传感器，在生物计量学中具有高灵敏度、低检测限和高特异性，已广泛用于病原体检测。然而，标准化和商业化仍是推动传感器广泛应用的关键。

无论是分离培养、免疫学检测，还是分子生物学检测，都有各自的局限性，新型检测技术为MP感染的早期诊断带来了新的可能，但受限于当前的发展阶段，其大规模运用仍面临挑战。

因此，在临床实践中需要综合考量各种MP检测方法的特点，根据应用场景选用适宜的病原学诊断方法，以实现最佳的诊断效果。

来源：陈添, 蔡秦真, 陶宇煊, 王军, 商宇, 伍墨, 庹文彬, 袁纯辉, 向贇. 肺炎支原体实验室诊断方法研究进展[J]. 检验医学, 2026, 41(3): 299-306