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成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly in terspaced short palindromic repeats，CＲISPＲ)及其相关蛋白 (CＲISPＲ-associated proteins，Cas)系统是细菌和古细菌的一 种适应性免疫机制［1 ］ 。该系统通过ＲNA引导方式对外源 性核酸进行特异性识别和切割，保护细菌免受噬菌体和质 粒感染［2 ］ 。CＲISPＲ/Cas系统通过单向导ＲNA(single guide ＲNA，sgＲNA)识别靶向序列;Cas蛋白被激活后，除了对靶 标的顺式切割外，还能对周围小核酸片段进行反式切割［3 ］ 。 基于这些特性，CＲISPＲ/Cas系统近年来被广泛运用于核酸 检测领域，并展现出灵活靶向、快速响应、高特异性等优 势［4 ］ 。新冠疫情期间，基于CＲISPＲ/Cas系统的
1基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸检测技术体系的构建
构建基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸检测技术体系的核 心在于将Cas蛋白的生物学效应转化为可检测信号。按照 CＲISPＲ/Cas系统在检测技术体系中所体现的主要功能机 制，现有的构建方式可大致分为三类:(1)基于Cas蛋白的 靶向作用，构建核酸捕获探针;(2)基于Cas蛋白的顺式切 割，改变下游生物合成过程;(3)通过Cas蛋白反式切割，降 解各类报告探针。见表1。
1．1基于Cas蛋白的靶向作用第一类构建策略依仅赖于 Cas蛋白的靶向识别，结合分裂荧光素、侧向层析和电化学 传感器等技术，实现信号输出。
分裂荧光素是一种将完整的荧光素酶分为2个无活性 片段，在特定条件下重新组合，恢复活性并产生荧光信号的 技术。利用仅保留DNA结合功能、去除切割活性的去活化的Cas9(dead Cas9，d Cas9)分别与荧光素酶的2个片段 (NFluc和CFluc)相连，组成荧光素－d Cas9复合物。该复合 物在sgＲNA引导下可靶向结合至目标DNA序列上、下游， 使2个荧光素酶片段靠近并恢复活性，从而实现对
在CＲISPＲ/Cas9介导的侧向层析(CＲISPＲ/Cas9-medi ated lateral flow nucleic acid assay，CASLFA)系统中(图1B)， Cas9与DNA结合形成复合体，利用金纳米颗粒靶向该复合 体，实现侧向层析检测。CASLFA系统充分利用了Cas蛋白 的高特异性，用于单核李斯特菌和非洲猪瘟病毒的检测，准 确率与荧光定量PCＲ(quantitative polymerase chain reaction， q PCＲ)相当［10 ］ 。类似的原理被用于血流感染中金黄色葡萄 球菌的检测，检测限为102CFU/m L［11 ］ 。相较于传统核酸侧 向层析，Cas9的应用在一定程度上减少了非特异性信号，提 高了检测的灵敏度和特异性。
利用d Cas9对循环肿瘤DNA的特异性捕获，结合电化 学传感器，构建了基于CＲISPＲ的电化学检测方法。该系统 应用于表皮生长因子受体(epidermal gowth fctor rceptor， EGFＲ)相关基因检测，检测限达2．86 fmol/L(相当于0．001% 的突变率)，动态范围宽度达6个数量级［12 ］ 。 基于Cas蛋白的靶向识别功能，通过多种信号输出模式 实现了核酸的高特异性检测。然而，这些策略未充分发挥 Cas蛋白的特性，Cas蛋白激活后的切割活性甚至会干扰检 测。因此，研究逐渐聚焦于构建更契合Cas蛋白功能特性的 检测系统。
1．2基于Cas蛋白的顺式切割活性靶标识别后，被激活的Cas蛋白对靶标核酸特异性的顺式切割。据此，开发了最 早的针对寨卡病毒的纸基CＲISPＲ核酸检测方法(图 1C)［13 ］ 。通过基于核酸序列的扩增技术(nucleic acid se quence-based amplification，NASBA)对底物进行预扩增，随 后引入CＲISPＲ/Cas系统，将Cas9蛋白切割作用转化为下 游生物传感器的可检测信号变化，从而实现检测并区分不 同病毒亚型［13 ］ 。该方法充分发挥了CＲISPＲ系统的特异 性，并展示了CＲISPＲ系统的顺式切割在核酸检测中的应用 潜力。
然而，Cas9的切割效应主要影响后续生物合成过程，涉 及复杂的下游信号转换和输出。为了简化设计，研究者聚 焦于Cas9介导的单链切割机制。通过切口生成，结合DNA 聚合酶链置换活性，构建了切口驱动型的等温扩增反应(图 1D)，用于
1．3基于Cas蛋白的反式切割活性激活后的Cas蛋白除 了顺式切割靶标外，还具备反式切割核酸报告探针的能力。 基于Cas13开发出了“夏洛克”系统(specific high-sensitivity enzymatic reporter un LOCKing，SHEＲLOCK)，用于寨卡病毒 的检测(图1E)［17 ］ 。同样地，依靠Cas12a反式切割活性的 检测系统也成功运用于多种病原体检测［18 ］ 。受这两项研究 启发，新冠疫情期间CＲISPＲ/Cas系统被成功应用于 SAＲS-CoV-2检测［19 ］ 。 受限于反应动力学特性［6 ］ ，对于使用荧光报告探针的 检测方法，最低检测限仅能达到pmol级［20 ］ 。因此，大部分 采用Cas蛋白反式切割活性的检测方法需要借助预扩增或 者其他信号放大系统。将荧光报告探针与扩增模板整合为 单一复合结构，形成自触发回路，通过双重扩增和荧光信号 放大，从而实现对细胞外囊泡中的低丰度ＲNA的高灵敏度 (amol级)、单核苷酸分辨率检测［21 ］ 。 Cas9在一定条件下，也具有反式切割活性。使用 CＲISPＲＲNA(crＲNA)和转激活CＲISPＲＲNA(trans-activa ting CＲISPＲＲNA，tracrＲNA)进行靶向而非sgＲNA，Cas9蛋 白表现出特定碱基偏好的ss DNA底物的反式切割活性。据 此原理，开发了DNA激活的Cas9检测系统，成功检测到 3．7 copies/μL的
2基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸检测技术的改进优化
基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸检测技术的临床转化，需 克服PAM限制、检测效率以及系统集成等问题。PAM依赖 性导致了CＲISPＲ系统靶向范围受限，在某些疾病相关的基 因突变位点附近，可能没有合适的PAM序列［23 ］ 。受限于 Cas蛋白的酶切速率，CＲISPＲ系统信号转换效率相对较低， 检测灵敏度局限于皮摩尔级别［6 ］ ，远低于q PCＲ的10～100 amol/L灵敏度。此外，许多检测体系集成不足，多阶段级联 的检测设计要求反应分步进行，涉及不同的反应条件
2．1 CＲISPＲ/Cas系统基因工程改造PAM依赖性限制了 CＲISPＲ系统的靶向范围，而通过基因工程改造Cas蛋白及 其辅助ＲNA(如sgＲNA或crＲNA)，可有效克服这一局限， 提升检测性能。
新型Cas9嵌合酶SpＲYc，整合了两种酶的特性，将 PAM范围拓展至5'-NYN-3'，并且脱靶效应显著降低［24 ］ 。 通过先祖序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASＲ) 技术获得Cas12a的古源蛋白Ｒe Chb，其切割几乎不依赖 PAM，底物涵盖ds DNA、ss DNA和ssＲNA，能对多种核酸进行 非特异性反式切割［25 ］ 。新鉴定的Plm Cas12e展现出更强的 反式切割活性和更低的顺式切割盐敏感性，因而获得更大 的信号放大效应［26 ］ (图2A)。同时，sgＲNA或crＲNA的修饰和工程化设计，也促进了CＲISPＲ/Cas检测系统的进化。 在crＲNA间隔区引入3个光敏基团NPOM-dT修饰，实现时 空可控的CＲISPＲ反应激活(图2B)［27 ］ 。工程化tracrＲNA (Ｒptr)通过重新编程，引入非典型crＲNA(ncrＲNA)，构建了 识别能力更强的检测体系［28 ］ 。综上所述，通过一系列对 Cas蛋白和sgＲNA的基因工程改进，提升了CＲISPＲ/Cas系 统的检测性能，并拓宽了检测范围，有助于克服CＲISPＲ/Cas 系统自身限制。
2．2信号放大策略优化为提高体系的检测性能，目前研 究通过整合多种信号放大策略，在灵敏度方面取得了明显 突破。主要包括荧光报告系统优化、纳米酶催化放大和非 扩增检测策略等。
传统的荧光染料报告探针信噪比有限，近年来，多种新 兴技术被引入以提升探针性能。以金纳米颗粒作为核心， 设计三维球形排列的核酸探针，通过荧光共振能量转移 (förster resonance energy transfer，FＲET)有效猝灭荧光，提高 了检测的信噪比［29 ］ 。利用嵌合肽－肽核酸，将荧光标记的发 夹DNA或ＲNA连接到Zn S包覆的量子点表面，通过FＲET 机制，构建信噪比更高的荧光报告探针(图2C)［30 ］ 。并且， 有研究通过量子点报告探针的使用，同时增强了体系的抗 污染能力，结合适配体，成功运用于血液中循环肿瘤细胞的 检测［31 ］ 。使用辣根过氧化物酶标记的微球探针，系统灵敏 度进一步提高，对SAＲS-CoV-2 OＲF1ab基因的检测限达10 fmol/L［32 ］ 。探针结构与信号机制的不断创新，提升了体系 的灵敏度。
纳米酶催化放大机制是提升CＲISPＲ/Cas检测系统灵 敏度的另一有效手段。基于MnO2纳米酶，构建ss DNA MnO2-MBs报告系统，根据3，3'，5，5'－四甲基联苯胺(3，3'， 5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)的颜色变化，实现低至10 copies/μL的SAＲS-CoV-2的现场可视化检测［33 ］ 。利用 DNA与β－半乳糖苷酶共轭物，构建伤寒沙门菌的比色传感 器，检测限低至8．59 pmol/L［34 ］ 。采用核酸适配体级联信号 放大，通过MnO2的蚀刻释放Mn2+来激活DNA酶，进而解除 对CＲISPＲ系统的阻断，实现了对
为了规避非特异性扩增的假阳性风险，非扩增策略被 引入CＲISPＲ/Cas传感器的开发。结合微流控和电化学系 统，利用
2．3体系集成整合通过数字微流控技术和便携式设备的 开发，实现了检测系统的高效整合，大大推进了CＲISPＲ检 测系统的实际应用。
数字微流控技术可以显著减少反应体积量，增强靶标 分子和报告分子的局部浓度［38 ］ 。结合微室装置和磁珠富集技术，基于CＲISPＲ-Ltr Cas13a的全自动无扩增数字ＲNA检 测平台(图2E)，可在9 min内以6．5 amol/L的检测限实现 SAＲS-CoV-2及其Alpha、Delta、Omicron等变异株的快速检 测，临床一致性为98%［39 ］ 。仅需简单地修改靶向分子，即可 实现对miＲNA及细菌16S rＲNA的单分子数字化定量。
针对现场检测，便携式检测设备克服了传统检测模式 的大型仪器限制。整合等温扩增和纸基芯片技术，利用 CＲISPＲ/Cas12a消除扩增的假阳性，保留纸基芯片便携和易 于储存特性的同时，实现了多种复杂样本的核酸便携检测。
纸基微流控空间编码芯片结合CＲISPＲ/Cas12a和等温扩 增，实现了30种核酸的快速、高灵敏度以及准确检测。该芯 片成功应用于人乳头瘤病毒亚型分型和呼吸道病毒检测， 检测时间为40 min，检测限为0．26 amol/L，临床一致性为 97．8%［40 ］ 。此外，利用纳米多孔膜分隔，将CＲISPＲ组分与 扩增组分分隔，结合葡萄糖生物传感技术，利用葡萄糖仪实 现了
3小结与展望
基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸检测技术自问世以来，已 有相关产品用于临床检测。2020年，美国食品和药物管理 局(FDA)首次批准了基于Cas13的“夏洛克”检测系统［17 ］ 用 于冠状病毒检测。国内，上海伯杰医疗公司的恒温CＲISPＲ 法和杭州众测生物公司的CＲISPＲ免疫层析法试剂盒，已在 国家药品监督管理局(NMPA)完成注册流程。目前，这些产 品主要应用于病原体快速检测，检测靶标仍然有限。
未来，通过CＲISPＲ/Cas系统的基因工程改造，筛选和 构建高性能的Cas蛋白，克服PAM限制，有助于CＲISPＲ/ Cas系统突破自身局限并提升检测性能。通过信号放大策 略优化，提升检测灵敏度。通过体系集成整合，简化检测步 骤，开发多重检测，将有助于基于CＲISPＲ/Cas系统的核酸 检测技术快速转化，在病原微生物和肿瘤相关的核酸检测 中发挥重要作用。
4参考文献略。
来源：李云武,朱叶飞.基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术及其研究进展[J].临床检验杂志,2025,43(10):762-766.DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2025.10.09.
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