作者：李泽宇，刘岳，湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要疾病之一，占所有脑卒中的大部分。IS 的发生是由于脑血管的突然阻塞，导致大脑特定区域的血流中断，进而引发脑组织和脑细胞的不可逆损伤。

尽管经过多年的研究和临床实践，目前的治疗方法(如溶栓和机械取栓等)在一定程度上降低了IS 的病死率，但其致残率依然居高不下，并伴有多种可能的严重并发症和风险。此外，这些治疗方法的时间窗非常狭窄，限制了其应用效果。

近年来，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植作为一种新的IS 治疗手段，受到了广泛关注。研究表明，NSCs 主要通过旁分泌的方式发挥作用，而外泌体(Exosomes)是其主要的效应物质之一。NSCs 分泌的外泌体(NSCs-Ex)携带多种生物活性物质，不受血脑屏障的阻挡，在体内既可以避免免疫排斥和致瘤性，又能够促进神经功能恢复和血管重建，同时在体外也易于获得和存储，NSCs-Ex 渐渐成为了干细胞治疗的有效替代品，且不会表现出干细胞治疗中的缺点。

最近研究表明，NSCs-Ex 在细胞和动物模型中均表现出显著的神经保护作用，如改善损伤后的神经功能，减少神经元凋亡，降低小胶质细胞的活化等，从而减轻神经炎症。这些发现为IS 的治疗提供了一种新思路。

1. 神经干细胞外泌体概述

外泌体是由活细胞分泌的双层膜囊泡，内含多种蛋白质、各种RNA(如miRNA、ncRNA 等)以及脂质，在体内的生命活动和细胞间通讯中起着至关重要的作用。NSCs-Ex 是一种直径在30~150 nm之间的外泌体囊泡，携带着多种生物活性组分。

神经干细胞外泌体的分离和提取程序与其他来源的外泌体的分离和提取程序非常相似，主要包括六种技术：超速离心、超滤、免疫亲和捕获、利用聚乙二醇(PEG) 的聚合物沉淀、尺寸排阻色谱和微流控技术。这些方法中的每一种都有其独特的优点和局限性。根据文献综述，超速离心是所有外泌体提取技术中最常用的方法，由于其易于操作、成本效益高、适用于大规模制备而成为主要的分离方法。

2. NSCs-Ex 在IS 中的作用机制

缺血性脑卒中(IS)的原因主要是血管血栓的形成，从而导致相应区域脑组织供血不足，这会引起一系列复杂的病理生理过程，包括局部氧自由基的生成与活性氧的产生、组织通透性的显著提升、脑组织的显著水肿现象、免疫炎症细胞的局部浸润加剧，以及神经炎性反应的不断演进与血脑屏障的严重破坏等关键环节，这些均在相关研究中得到了详尽阐述。

尤为重要的是，血脑屏障的受损将直接促使促炎细胞因子在受损区域大量积聚，而且最终会触发不可逆的神经组织损伤。临床的溶栓、取栓等治疗就会因为这种不可逆的损伤而达不到预期效果。近年来，神经干细胞移植逐渐成为热门话题，相关研究也数不胜数，但越来越多的研究表明神经干细胞移植后是其旁分泌作用在起主要作用。而NSCs-Ex 作为神经干细胞旁分泌的一种重要媒介，在近期的研究中发现其可调节下丘脑显著延缓衰老，并在细胞和动物模型中表现出对神经损伤的保护作用以及促进神经元产生的潜力。

2.1 NSCs-Ex 对IS 后神经元的保护

在IS 中，由于大脑动脉血栓栓塞，局部缺血缺氧加剧了神经细胞的凋亡，最终导致不可逆的损伤。因此，在IS 后，促进血液的重新循环，抑制神经元的凋亡，促进内源性细胞向神经元的转化以及时补充神经细胞的不足显得尤为重要。刘清月在体外构建神经元氧糖剥夺模型(oxygen - glucose deprivation， OGD)， 通过RTCA、TUNEL、DCFH-DA 及WB 等检测细胞活力、凋亡等指标，发现NSCs-Ex 提高了损伤后的神经元活力，并抑制了其凋亡，促进核因子E2 相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)向核内转移，缓解氧化应激。随后在Matrigel 胶上通过共培养后评价发现，NSCs-Ex 对受损神经元的轴突再生及血管重建有积极作用。

同时，研究证实NSCs-Ex 会抑制受损的NSCs 自身凋亡及向星形胶质细胞的分化。在体外实验中，多位学者均采用大鼠大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模拟缺血性脑卒中动物模型进行实验，通过NSCs-Ex尾静脉注射治疗后与PBS 组及假手术组对比，发现MCAO 大鼠存在神经元轴突断裂，神经元凋亡增多，细胞核固缩等改变，而NSCs-Ex 逆转了这一结局，改善了神经行为缺陷，揭示了NSCs-Ex 对于减少梗死体积、促进神经功能恢复，起着积极的作用。

在更深层次机制的研究中，林超群的体外实验结果表明，上调miR-9a-5p 的海马神经干细胞所分泌的外泌体(miR-9a-5p-NSCs-Ex)，在OGD/ R细胞模型中显著增强了海马神经干细胞OGD 后的增殖与分化能力，并抑制其凋亡，同时促进了AMPK的磷酸化。

miR-150-3p 是caspase 2 基因的上游调节性miRNA，罗宏成在研究中发现miR-150-3p是NSCs-Ex 中上调最明显的miRNA，通过对miR-150- 3p 的研究表明， 其对凋亡相关基因Bax、cleaved-caspase 3 和Caspase 2 的表达呈抑制作用，而对抗凋亡基因Bcl-2 的表达则是诱导促进，并促进了神经细胞的增殖。

2.2 NSCs-Ex 促进IS 后血管的重建

血管新生在改善脑缺血损伤和促进神经功能修复方面发挥着重要作用。它不仅在机体的自我修复过程中至关重要，而且在治疗缺血性脑卒中时也是一个关键目标。而NSCs-Ex 是神经血管联系中的关键参与者，通过转运外泌体中的蛋白质和miR⁃NA 等分子，有效介导神经血管的重建。

Gu C 等将神经干细胞外泌体(NSCs-Ex)负载于透明质酸(HA)制备的黏附性水凝胶中，并构建了小鼠中脑动脉闭塞(MCAO)模型。随后，通过立体定向注射将PBS、NSC-Exo、HA 和NSC-Exo-HA 水凝胶分别注入小鼠体内。在第28 天时，对MCAO 模型中缺血部位进行免疫荧光(IF)染色，检测微血管生成标志物(vWF)，以评估缺血区域的微血管生成情况。结果显示，NSC-Exo 组中vWF 的荧光强度显著高于PBS 组(P 值<0.05)。

此外，NSCExo-HA 组的vWF 荧光强度显著高于其他组(P 值<0.05 vs. NSC-Exo 组，P 值<0.05 vs. HA 组)。在对缺血部位进行CD31 染色时，发现NSC-Exo-HA 组中CD31 的表达显著增加，表明该组有效促进了血管内皮细胞的形成。Liu Q 等为评估hNSCs-Exo(人类神经干细胞来源的外泌体)对IS 后神经元的保护作用，在体外神经元缺氧再灌注(hypoxia/ reoxygenation，H/ R)模型中，通过TUNEL 法检测神经元凋亡情况，结果显示经过hNSCs-Exo 干预的神经元TUNEL 阳性细胞数和凋亡率均显著低于H/ R 组(P<0.05)。

这表明hNSCs-Exo 可以显著减轻氧化应激对神经元的损伤，并抑制其凋亡。此外，利用Western Blot 检测各组Nrf2 蛋白的表达情况，结果显示H/ R-hNSCs-Exo 组的Nrf2 蛋白核浆比显著高于H/ R 组(P<0.01)，表明hNSCs-Exo 有效促进了Nrf2 抗氧化分子的核转移，以抵抗氧化应激。在神经元轴突生长方面，H/ R-hNSCs-Exo 组的轴突平均长度为(218.4 ± 9.879) μm，显著长于H/ R 组的(105.8±3.583) μm，说明hNSCs-Exo 可以促进神经元轴突在H/ R 状态下的生长。

最后，在基质胶中将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)与hNSCs-Exo 共培养，在显微镜下发现与对照组相比，hNSCs-Exo 组中发现了更多数量的血管腔和分支，根据Image J 统计，与对照组相比，hNSC-EV 组中的节点数(NB)和总分支长度显著高于对照组(P<0.05)，与H/ R 组相比，H/ R-hNSCs-Exo 组的HUVECs 血管分支数量、节点数和总分支长度均显著增加(P<0.05)，提示hNSCs-Exo 具有促进血管生成的作用。

2.3 NSCs-Ex 在IS 中的抗炎和免疫调节作用

在缺血性脑卒中中，炎性反应是导致神经损伤的重要因素之一。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要免疫细胞，在启动和调节炎性反应中起着关键作用。在IS 发生时，小胶质细胞迅速迁移至受损部位，并通过向M1 和M2 两种类型极化发挥作用。M1 型小胶质细胞主要促进炎性反应，表达标志性蛋白CD86;而M2 型小胶质细胞则发挥抗炎作用，表达标志性蛋白CD206。研究表明，神经干细胞外泌体(NSCs-Ex)在调节小胶质细胞极化和减轻炎性反应方面具有显著效果。

Zhao X 等通过将SD 大鼠随机分为假手术组、MCAO 组、PBS 组和MCAO+NSCs-Ex 组进行试验，发现经过NSCs-Ex 治疗后，显著降低了CD86 的水平，并增加了CD206 的表达水平。这表明NSCs-Ex 能够促进小胶质细胞向抗炎的M2 型极化，从而减轻神经炎症和损伤。此外，NSCs-Ex 还通过调节炎性因子的表达来发挥抗炎作用。在大鼠MCAO模型中，经NSCs-Ex 治疗后，脑脊液中的TNF-α 和IL-1β 的含量显著低于对照组，而抗炎因子TGF-β1 和IL-10 的水平则显著升高。

这进一步证明了NSCs-Ex 在减轻炎性反应和促进神经保护方面的潜力。氧化应激是IS 中另一个重要的病理过程，NRF2 是氧化应激中的关键调节因子。Li Z 等研究首次发现，NSCs-Ex 中的脂肪和肥胖相关基因(fat mass and obesity-associated，FTO)通过m6A 依赖的方式转移，促进了小胶质细胞中NRF2 的mRNA 及蛋白表达，并促进了小胶质细胞向M2 型极化。这一发现揭示了NSCs-Ex 在调节小胶质细胞极化和减轻氧化应激方面的独特机制。总的来说，NSCs-Ex 通过多种机制在IS 中发挥抗炎和免疫调节作用。这些机制包括促进小胶质细胞向M2 型极化、调节炎性因子的表达以及减轻氧化应激。

2.4 修饰NSCs-Ex 在IS 中发挥与NSCs-Ex 同样甚至更有效的作用

在过去几年中，神经干细胞(NSCs)移植治疗缺血性脑卒中(IS)的研究取得了显著进展，但其缺点也逐渐暴露，如移植后存活率低、不稳定的致瘤性和免疫反应等问题。相比之下，NSCs 分泌的外泌体(NSCs-Ex)能够避开这些问题，作为纳米级的小囊泡，NSCs-Ex 可以透过血脑屏障，在各种中枢神经系统疾病中发挥作用。

在体外研究中，已经发现多种物质对受损神经元具有保护甚至修复作用。因此，近期的研究逐渐集中于修饰NSCs-Ex，使其携带各种物质进入血脑屏障，从而发挥更有效的治疗作用。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种能够促进神经系统细胞生长、分化、突触生长及神经生长的神经营养物质，并在缺血后和创伤性脑损伤中显示出许多神经保护特性。

朱治翰采用过氧化氢(H2O2 ) 处理细胞形成氧化应激模型，利用BDNF 转染的NSCs-Ex(BDNF-NSCs-Ex) 进行干预。通过WB、CCK-8、TUNEL、q-PCR、免疫荧光等实验证实，BDNF-NSCs-Ex 不仅促进了神经干细胞向神经元的分化，还减轻了神经干细胞的损伤和凋亡。在MCAO 大鼠模型中，BDNF-NSCs-Ex 显著减少了脑梗死体积，改善了受损的神经功能，并抑制了小胶质细胞的表达。通过免疫荧光检测显示，BDNF-NSCs-Ex 组在梗死区域周围产生了更多的功能性神经元，表明BDNF通过NSCs-Ex 携带进入受损部位，抑制小胶质细胞的活化，从而减轻神经炎症，促进组织恢复。

干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ) 在ZhangG的研究中被发现，通过与神经干细胞共递送，能够增加移植的神经干细胞在脑卒中中的耐氧化应激能力，促进其向神经元的分化，并增强神经元功能，从而提高移植的有效性。在后续的实验中，研究者通过转染IFN-γ 的神经干细胞，利用其外泌体(IFN-γ-NSCs-Ex)应用于H2O2 刺激的NSCs。实验结果显示，IFN-γ-NSCs-Ex 使NSCs 更加耐受H2O2的刺激，显著增加NSCs 的生物活性并减少其凋亡。

在动物实验中，通过MRI 评估大鼠脑梗死体积，发现IFN-γ-NSCs-Ex 组与NSCs-Ex 组相较于PBS 组MCAO 模型中的梗死体积均减少了，且IFN -γ -NSCs-Ex 组的效果更显著。这表明IFN-γ 通过NSCs-Ex 携带至损伤部位，能够更有效地减轻神经损伤。

3. 总结

近年来，神经科学和再生医学的飞速发展，使得神经干细胞移植治疗的存活率低、不稳定的致瘤性和免疫反应等缺点也越来越明显，而其分泌的外泌体在缺血性脑卒中的治疗潜力逐渐显现。这些具有强大生物活性的纳米级囊泡，以其独特的细胞间通讯和生物分子传递功能，为缺血性脑卒中的治疗开辟了新的道路。当前，针对缺血性脑卒中，神经干细胞来源外泌体(NSCs-Exo)的研究还处于早期阶段，其潜在应用和作用机制，如NSCs-Ex 在缺血性脑卒中中的神经保护和血管再生等更深层次的机制仍需进一步探索。

而NSCs-Ex 的提取和纯化方法存在效率低、纯度不足等问题，在临床应用前仍需要进行长期、大规模的动物实验和临床试验以全面评估其安全性和有效性。此外，利用NSCs-Ex 的特殊性质，开发新型药物递送系统，有望提高药物的靶向性和治疗效果。最后，结合传统的溶栓治疗、机械取栓等方法，探索NSCs-Ex 与其他治疗手段的联合应用，可能会取得更好的治疗效果。综上，NSCs-Ex在缺血性脑卒中的应用进展令人瞩目，其独特的生物活性和治疗潜力为治疗提供了新的可能。

来源：李泽宇，刘岳.神经干细胞外泌体在缺血性脑卒中的研究进展[J].湖北医药学院学报，2025，44(01)：113-118.DOI：10.13819/j.issn.2096-708X.2025.01.023.

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