作者：乔颖婕，黄心智，上海交通大学医学院

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤，在头颈部鳞状细胞癌中约占40%。因其转移快、易复发、耐药率高，晚期预后不理想。了解其发病和进展机制，寻找预后生物标志物和治疗靶点是改善预后的关键。单细胞测序技术相较大体测序能提供更准确的细胞特异性转录组信息，有助于细胞亚型分群、差异基因表达分析、细胞间通讯模拟和发育演化研究。空间转录组技术则在此基础上保留了细胞的空间位置信息，进一步扩展了单细胞测序的功能。

本文综述了单细胞测序在OSCC研究中的应用，包括细胞分型、肿瘤侵袭和转移机制、肿瘤微环境和免疫浸润特性、治疗靶点和预后标志寻找、靶向免疫疗法优化、肿瘤内微生物对肿瘤生态系统的影响；最后介绍了空间转录组技术在OSCC研究领域的应用。这些测序技术为OSCC研究提供了新的视角，能提高研究的深度和精准度，有推广利用的价值，但仍需克服其局限性。

1. 单细胞测序在OSCC相关研究中的应用

1.1 单细胞测序应用于OSCC细胞分型

正确判断组织细胞类型对肿瘤诊断、治疗方案选择、治疗预后等具有指导意义。目前OSCC被归类为4个亚型：基底型、间充质型、典型型，和非典型型。Puram等运用单细胞测序技术评估后发现OSCC恶性细胞能够被定性为典型型、非典型型、基底型3种亚型，而间充质亚型癌可能指代含有大量间质细胞的恶性-基底亚型癌，因此OSCC可被重新划分为恶性-基底型、典型型、非典型型3种亚型，相较基于大体测序的分型更加精准。

1.2 单细胞测序应用于OSCC微环境研究

OSCC的微环境主要由癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast, CAF)、成纤维网状细胞(fibroblastic reticular cell, FRC)、免疫细胞、凝血和纤溶调节因子等构成。通过单细胞测序技术，研究者可以深入了解OSCC微环境的特征。Yang等识别出两种主要CAF：介导免疫抑制的炎症性癌症相关成纤维细胞(iCAFs)和介导肿瘤粘附的肌性癌症相关成纤维细胞(mCAFs)。mCAFs使基质硬化而被iCAFs降解，后者释放生长因子促进肿瘤转移。

Zhang等进一步鉴定出8种CAF亚型，揭示了OSCC中CAF的异质性。Song等研究了OSCC化疗后的肿瘤免疫微环境，发现部分CAF亚型可能参与化疗后免疫微环境的改善，可能是潜在治疗靶点。Chen等利用单细胞测序技术鉴定出OSCC肿瘤内和癌旁组织的T细胞亚群并分析细胞发育轨迹，发现肿瘤内富集调节性CD4+T细胞和耗竭CD8+T细胞，与肿瘤免疫抑制相关；转录因子TOX可能是T细胞功能障碍的关键。

Peng等分析了OSCC肿瘤浸润性转录因子7(transcription factor 7, TCF7)+T细胞，发现其与三级淋巴结构的数量、位置有关，且低表达免疫检查点分子，具有作为治疗靶点和预后标志的价值。Han等对OSCC转移与非转移颈淋巴结中FRC的差异表达基因进行细胞成分GO富集分析，发现转移淋巴结的FRC可能具有吸收癌细胞胞外小泡的功能。被FRC吞噬的γ干扰素受体1(interferon gamma receptor 1, IFNGR1)促进FRC上程序性细胞死亡配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)表达，导致CD8+T细胞耗竭增加，利于转移环境的形成。

Lottin等研究了OSCC肿瘤微环境中凝血和纤溶调节因子的差异，发现OSCC中同时存在高表达促凝血因子组织因子(tissue factor, TF)和促纤溶因子尿激酶(urokinase-type plasminogen activator, PLAU)的癌细胞亚群，且观察到TF的高表达与一些关键免疫检查点分子表达存在关联，提示凝血和纤溶调控微环境对OSCC肿瘤适应性免疫机制的影响值得进一步研究。

1.3 单细胞测序应用于OSCC侵袭和转移研究

OSCC易淋巴结转移，单细胞测序技术能够深入探索个体癌细胞和间质细胞的基因表达，为研究肿瘤侵袭和转移提供新的视角。Li等通过分析槟榔碱相关的OSCC的单细胞测序数据，找到一组槟榔碱关联纤维化相关OSCC的差异表达基因，这些基因在OSCC中高表达，并与CAF的存活和肿瘤转移呈正相关。

Puram等发现OSCC缺乏经典上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)转录因子的partial EMT(p-EMT)程序。Reed等则认为OSCC中β-连环蛋白(β-catenin)/cAMP应答元件结合蛋白结合蛋白[cAMP-response element binding protein(CREB)-binding protein, CBP]和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)信号转导有关，可能促进p-EMT。单细胞测序数据分析可揭示p-EMT恶性细胞和附近CAF间的相互作用。

Huynh等聚焦两种CAF亚群与p-EMT恶性细胞间的通讯，发现CAF的肿瘤坏死因子超家族成员12(tumor necrosis factor superfamily member 12, TNFSF12)在非转移条件下增加了与肿瘤坏死因子受体超家族成员25 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 25, TNFRSF25)的联系，在转移条件下则增加了与p-EMT肿瘤细胞肿瘤坏死因子超家族成员12A(tumor necrosis factor superfamily member 12A, TNFRSF12A)的联系，结合临床生存数据，认为TNFRSF12A可作为OSCC不良预后标志。Horny等在OSCC淋巴结转移样本发现间质-上皮转化机制，帮助解释OSCC中的上皮-间质可塑性相关恶性细胞、基质细胞异质性及其对肿瘤转移过程的影响。

1.4 单细胞测序应用于寻找OSCC治疗靶点与预后标志研究

相较于大体测序，单细胞测序能够分辨标志基因表达的具体细胞来源，精准定位所要研究的细胞及分子模式，有助找到特定治疗靶点，或结合临床数据寻找预后标志。Liu等在槟榔相关OSCC中找到p-EMT前缘间质CAF表达的转化生长因子β诱导蛋白(transforming growth factor-beta-induced protein, TGFBI)和内皮细胞表达的透明质酸酶1(hyaluronidase-1, HYAL1)作为预后标志。

Hu等发现一群OSCC癌巢远端表达色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)的肌成纤维细胞，周围富集CD4+和CD8+的T细胞，推测TDO2+细胞可成为削弱T细胞免疫抑制状态的潜在靶点。Gao等发现舌鳞状细胞癌中周期蛋白依赖性激酶调节亚基2(cyclin-dependent kinases regulatory subunit 2, CKS2)表达与细胞周期进程相关，抑制其表达可能减缓癌细胞生长，诱导G2/M期阻滞。

Glathar等利用小鼠细胞研究OSCC增殖和转移，认为致癌转录因子p63调节的辅乳糖蛋白样蛋白1(coactosin-like protein 1, COTL1)可作为人OSCC治疗新靶点。回顾性分析单细胞测序结果可以寻找预后标志。Wang等研究了OSCC转移与原位肿瘤免疫微环境异质性，发现由更晚期恶性细胞表达的卷曲螺旋结构域蛋白43(coiled-coil domain-containing protein 43, CCDC43)上调可作为不良预后标志。

Hu等发现信号肽酶复合物亚基基因 (SEC11 Homolog A, SEC11A)上调是OSCC不良预后标志。Chen等则发现PD-1/PD-L1表达相关的白介素-12受体β1基因(interleukin-12 receptor beta 1, IL-12RB1)可作为OSCC生存预后标志。此外单细胞测序数据还能用于开发疾病预后评估模型及淋巴结转移预后模型。

1.5 单细胞测序应用于OSCC免疫治疗研究

单细胞测序在分析免疫细胞谱、免疫细胞间通讯方面具有优势，有助于在OSCC治疗中开展免疫检查点阻断疗法(immune checkpoint blockage, ICB),可提供靶向疗法预后参考。Zhou等在单细胞水平比较了抗PD-1疗法敏感与抵抗的两种OSCC小鼠模型，在接受ICB治疗后的肿瘤浸润CD8+T细胞异质性和克隆特性，证实存在CD8+T祖细胞和效应T细胞，发现ICB疗法能够诱导肿瘤浸润PD1-幼稚T细胞向PD1+效应T细胞分化。

Luoma等针对接受抗PD-1或抗PD-1/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)联合治疗临床试验的OSCC患者肿瘤浸润和外周循环免疫细胞进行单细胞测序分析，确认携带组织驻留记忆基因程序的肿瘤浸润CD8+T细胞为ICB疗法的早期响应细胞群，解析其基因表达特征，找到数个可预测ICB响应预后的生物标志物。

Zhang等分析数据库后找到与OSCC中CD8+T细胞浸润水平相关的8个基因，可作为免疫疗法预后标志。He等发现脂滴包被蛋白2基因(perilipins2, PLIN2)在OSCC微环境高表达，同时一些免疫检查点分子增加，伴随免疫抑制，提示PLIN2表达上调可能与ICB抵抗相关。Zhang等利用单细胞测序绘制头颈部鳞状细胞癌三级淋巴结构相关趋化因子受体细胞图谱，分析细胞功能和演化轨迹，提出可利用细胞固有趋化因子受体谱在头颈部鳞状细胞癌中诱导新生三级淋巴结构以增强ICB治疗反应。

1.6 单细胞测序应用于OSCC与肿瘤内微生物关系研究

临床上观察到多种实体肿瘤内部共存的细菌、真菌等微生物对癌症进展、转移、免疫监视和化疗耐药等有影响，但具体机制不明。单细胞测序技术可运用于微生物与肿瘤关系研究。如Galeano Niňo等设计了针对肿瘤相关细菌的单细胞测序方法(INVADE-seq),结合空间转录组技术，能反映OSCC肿瘤内微生物群对宿主细胞信号通路、分子表达变化的影响，揭示组织内细菌与免疫细胞和癌细胞有交互作用，会影响肿瘤的发展、免疫反应、转移、DNA修复等行为。该研究思路和方法适用于所有存在微生物群的癌症类型。

1.7 空间转录组技术应用于OSCC研究

空间转录组技术是在单细胞测序基础上发展而来的，可以更好地反映细胞在组织原位基因表达情况及相互关系，近年来逐渐被应用于OSCC研究，取得了比单细胞测序更多的成果。Arora等运用空间转录组技术发现OSCC肿瘤前缘区域基因表达保守，而肿瘤核心区域基因表达具有组织特异性。

在研究OSCC高代谢区域及其与局部免疫抑制的关系时，Liu等运用空间转录组技术发现单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1, MCT1)的过度表达、磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的激活促进了OSCC高代谢区成纤维细胞向CAF的转化、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α)上调，进而促进肿瘤微环境中调节性T细胞的招募和免疫抑制，促进OSCC的进展。

Zhi等结合空间转录组学分析OSCC及邻近上皮区域的细胞代谢组学特征，发现多胺代谢酶的异常表达会推动多胺代谢重编程，在免疫逃避和肿瘤恶性进展中起作用。Schmitd等运用空间转录组技术证实OSCC癌周神经的应激和生长反应随神经-肿瘤距离的增加而减弱，神经周侵袭阴性神经也可促进肿瘤进展，支持根据神经-肿瘤距离对神经周侵袭重新分类。

Sun等运用空间转录组技术绘制OSCC癌前病变的细胞和特定基因表达的空间分布图，证实癌前阶段上皮细胞相关基因表达增加，上皮细胞与基质细胞之间通讯频繁。Iwasa等运用空间转录组技术分析对免疫疗法产生获得性耐药的OSCC肿瘤及微环境变化，表明在免疫治疗前后，肿瘤区域的激活通路分别与癌症免疫系统、表观遗传修饰有关，微环境的激活通路分别与蛋白质代谢、信号转导有关，发现肿瘤的表观遗传修饰可以抑制抗PD-1抗体激活癌症免疫系统。

2. 目前单细胞测序用于癌症研究的不足

分析现有研究，单细胞测序的不足之处主要在于：

(1)研究深度不足。大部分研究揭示了肿瘤细胞图谱特征，确认了癌症关联因素，但对癌症机制乃至防治靶点的探索和验证较少。

(2)活体样本研究局限。一方面活检样本获取有一定门槛，另一方面活检样本处理复杂，导致对活检样本的测序少，多数研究是基于公开测序库分析，或细胞培养还原，这可能造成分析样本来源单一，不利潜在机制的临床推广验证，有待未来活检样本的单细胞提取技术改进。

(3)潜在机制的验证方案少。单细胞测序结果分析主要通过计算机模拟和预测，大多数研究缺少可视化或实验还原验证。关于验证方案，可以考虑多种转录组测序技术、多分辨率、多时空采样结合分析，以及设计体内外实验验证模拟结果。

(4)空间转录组技术比单细胞测序技术获得更多更准确的信息，但该技术目前尚不够完善且价格昂贵。

3. 结语

总之，单细胞测序技术有助于拓展OSCC已有研究，但由于使用价格高，技术尚未完善，需要科研人员有生物信息学技能等限制因素，使得其应用尚处在初始阶段。研究者应进一步挖掘数据库中信息，发现新的研究方向，特别是利用单细胞测序在开发OSCC新药物、新疗法、预后预测方面有更多的提升空间。

来源：乔颖婕,黄心智.单细胞测序在口腔鳞状细胞癌研究中的应用[J].口腔医学研究,2024,40(09):762-766.

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