近日，来自美国Univeristy of Texas Health Science Center的伍龙军教授团队在国际著名学术期刊Nature Neuroscience发表了题为“Astrocyte-microglia interaction drives evolving neuromyelitis optica lesion” 的研究论文。伍龙军教授为论文通讯作者。

前言

视神经脊髓炎（NMO）是一种严重的炎性自身免疫性中枢神经系统（CNS）疾病，主要由IgG自身抗体与星形胶质细胞上的水通道蛋白4（AQP4）结合引发，导致继发性的髓鞘损失。研究表明，细胞溶解补体的激活是NMO组织破坏的主要驱动因素，而小胶质细胞在该过程中也扮演重要角色。通过持续注入NMO患者血清衍生的IgG或AQP4特异性小鼠单克隆抗体，探讨了早期前细胞溶解事件的病理生理学。结果显示，运动障碍和免疫病理变化与IgG剂量、AQP4及小胶质细胞的活性相关。在体内脊髓成像中，观察到小胶质细胞与星形胶质细胞之间的显著相互作用，依赖于星形胶质细胞通过补体C3的C3a片段发出的信号。尽管星形胶质细胞保持活性，但AQP4的表达丧失。早期激活的CNS内源性补体成分与小胶质细胞的C3a受体信号之间的交叉对话，可能是NMO病变前细胞溶解阶段的重要驱动因素，提示小胶质细胞可能成为NMO治疗的潜在靶点。

研究结果

1. 建立具有逐渐运动障碍的NMO小鼠模型

为了研究NMO病理学的细胞和分子机制，研究开发了一个小鼠模型，使用从NMO患者血清中分离的IgG。通过将NMO-IgG或对照-IgG连续输注到小鼠的脊髓蛛网膜腔中，发现接受NMO-IgG的小鼠出现了逐渐加重的运动缺陷和后肢瘫痪，而对照组则未见运动障碍（图1A、B）。步态分析显示，NMO-IgG组的小鼠步幅显著减少（图1C、D）。检测脑脊液中的AQP4-IgG浓度发现，在NMO-IgG接受者中，抗体滴度超过1:500。进一步比较AQP4缺失小鼠（Aqp4–/–）与野生型小鼠的运动表现，发现Aqp4–/–小鼠在NMO-IgG输注后未表现出运动障碍（图1E、F），而野生型小鼠则严重受损。使用针对AQP4细胞外结构域的单克隆IgG同样在野生型小鼠中引发运动障碍（图1G），而AQP4缺失小鼠未受影响（图1H）。由于10 μg/天的人类NMO-IgG和1 μg/天的小鼠单克隆AQP4-IgG均诱导了显著的运动障碍，因此所有后续实验中使用了这两个相应的浓度。

图1. NMO小鼠模型的建立

2. NMO-IgG诱导AQP4丧失并激活星形胶质细胞

经过5天NMO-IgG注射的小鼠脊髓中，AQP4免疫反应显著降低，特别是在导管尖端周围（图2A）。Western blot分析显示，NMO-IgG接受者的AQP4含量低于对照组（图2B、C）。在对照组中，AQP4与血管标记物CD31共定位，表明其在星形胶质细胞足部的表达（图2D），而NMO-IgG接受者的脊髓血管完好（图2E），但由AQP4+足部覆盖的CD31+血管面积从68%降至19%。GFAP标记的星形胶质细胞在NMO-IgG注射后显著增加（图3A），GFAP+细胞体数量从188±35增加至536±72（图3B），且其占据的平均面积也显著增大。虽然没有观察到星形胶质细胞的丧失，但在NMO-IgG接受者中，NeuN免疫反应显著降低（图3C和D）。NF200和MBP的双重染色显示，轴突神经纤维染色保持，但与对照组相比，三分之一的轴突MBP免疫反应减少（图2A、B）。NMO-IgG注射小鼠脊髓中未检测到末端膜攻击复合物的免疫反应，排除了补体依赖的细胞毒性，而半胱天冬酶-3染色也未显示神经元凋亡（图2C、D）。这些结果表明，该模型再现了早期NMO病变特征。

图2. NMO-IgG在脊髓中诱导AQP4的丧失了PD-1抑制剂卡瑞利珠单抗+化疗用于无法手术I-IIA期NSCLC患者的疗效和安全性

3. NMO-IgG注射后，小胶质细胞在小鼠中被激活

通过对小胶质细胞标记物Iba1的免疫染色，发现NMO-IgG接受者的Iba1免疫反应强度、Iba1+小胶质细胞数量及其体积显著增加（图3A、B）。小胶质细胞形态从“静息”表型转变为“激活”灌木状表型（图3C、D），并且小胶质细胞过程复杂性减少（图3E）。在NMO-IgG接受者的脊髓组织中，CD68免疫反应增加（图4A、B），C1q免疫反应也随之增加（图4C、D），表明小胶质细胞是C1q的主要来源。对AQP4缺失小鼠注射NMO-IgG未增加Iba1+细胞数量或CD68免疫反应，而在野生型小鼠中，单克隆AQP4-IgG注射导致AQP4免疫反应下降、星形胶质细胞（图4A）和小胶质细胞（图4B）激活，以及NeuN免疫反应的丧失（图4C）。这些结果表明NMO-IgG与AQP4的相互作用引起星形胶质细胞的改变及显著的小胶质细胞激活。

图3. NMO-IgG诱导小胶质细胞激活

图4. NMO-IgG诱导小胶质细胞表型变化

4. 小胶质细胞的消融可以预防NMO-IgG诱导的运动功能障碍

NMO-IgG注射后小胶质细胞的激活表明其在NMO发病机制中可能起到作用。通过选择性消融小胶质细胞的方法，给予他莫昔芬（150 mg/kg，腹腔注射）以诱导Cx3cr1CreER/+:R26iDTR/+小鼠表达白喉毒素受体。注射白喉毒素（DT，50 μg/kg，腹腔注射）后1至3天，脊髓小胶质细胞被消耗；到第5至7天，小胶质细胞得以再生（图5A、B）。当NMO-IgG注射与最后一次DT注射同时进行时，小胶质细胞在第3天再生，并在第7天的数量超过基线水平或对照-IgG组（图5）。注射DT后，在小胶质细胞最大消耗期间，NMO-IgG未诱导明显的运动障碍（图5C），但在DT后约第5天，伴随小胶质细胞再生，严重运动障碍显现。无论小胶质细胞的存在与否，NMO-IgG均导致AQP4的丧失（图5D、E）。经过小胶质细胞消融的小鼠在NMO-IgG注射7天后NeuN免疫反应性丧失较轻（图5F、G），表明小胶质细胞在NMO中可能作为神经功能障碍的效应因子。

 图5. 小胶质细胞的消融可以防止NMO-IgG引起的运动障碍

5. NMO-IgG诱导星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用

共聚焦图像显示，在NMO-IgG注入后，GFAP+星形胶质细胞与Iba1+小胶质细胞的重叠显著增加，从基线的约17%上升到65%（图6B、C），尽管每种细胞类型的数量仅增加2到3倍。为确认这种融合，使用了Cx3cr1gfp/+小鼠和双重染色方法，均显示星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用增强（图6A-C）。此外，通过双光子成像在人活体Cx3xr1gfp/+小鼠脊髓中发现，在NMO-IgG注入后，小胶质细胞突起显著向星形胶质细胞汇聚（图6D、E），而在对照IgG注入后汇聚事件较少（图6F）。这些结果表明，NMO-IgG注入期间星形胶质细胞与小胶质细胞之间的相互作用显著增加，且这一相互作用并非仅由于细胞数量的增加。

图6. NMO-IgG诱导星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用

6. 早期补体成分的裂解产物信号在星形胶质细胞与小胶质细胞相互作用及NMO病变进展中起关键作用

组织病理学和体外研究表明，末端膜溶解补体成分在NMO病变中发挥重要作用。NMO-IgG与AQP4结合后，星形胶质细胞转录并分泌补体成分C3，C3转录本上调33倍。在NMO-IgG注入的老鼠脊髓中，C3免疫反应性显著增强（图7A、B），而对照IgG组主要在血管腔内（图7B）。NMO-IgG接受者的C3+GFAP+星形胶质细胞百分比约为对照组的4倍。小胶质细胞在NMO-IgG组中表现出C3a受体上调（图7C），重组C3a的应用诱导小胶质细胞过程的趋化（图7D、E）。为了进一步研究补体信号在NMO病理中的作用，在C3aR–/–和C3–/–小鼠中注入NMO-IgG，发现运动障碍未显著出现（图8B）。尽管NMO-IgG诱导的星形胶质细胞激活明显，但小胶质细胞激活及其与星形胶质细胞的相互作用在缺乏C3aR的小鼠中显著减弱（图8C、D）。这些结果表明，早期补体成分的信号及星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用在NMO的病理演变中具有重要意义。

图7. 补体信号驱动星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用

图8. 补体信号对NMO-IgG诱导的运动障碍和病理进展至关重要

研究讨论

小胶质细胞和星形胶质细胞之间的早期补体依赖性相互作用，这对于诱导早期 NMO 病理学至关重要。NMO-IgG 与静息星形胶质细胞末端足上的 AQP4 结合。IgG 的结合激活星形胶质细胞并诱导AQP4内化。活化的星形胶质细胞释放补体C3或C3a。C3a 与小胶质细胞C3a 受体（C3aR）的结合激活小胶质细胞并诱导向星形胶质细胞的过程收敛。活化的小胶质细胞上调 C1q 的产生并与星形胶质细胞相互作用，以及上调 C1q，这可能会促进补体级联反应，从而导致神经元损伤。总的来说，星形胶质细胞-小胶质细胞相互作用推动了 NMO 病理学的进化。表明小胶质细胞值得考虑作为 NMO 治疗干预的潜在靶点。

(本网站所有内容，凡注明来源为“医脉通”，版权均归医脉通所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：医脉通”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)