作者：中国科学院大学宁波华美医院骨科   宋蒙胜

甲状旁腺激素（PTH）是甲状旁腺主细胞分泌的多肽类激素，由1－84个氨基酸组成。其类似物是目前治疗骨质疏松症的促骨形成类代表性药物，如特立帕肽（teriparatide），为PTH氨基端1－34活性片段。PTH与在骨组织中的1型甲状旁腺激素受体（PTH1R）结合后发挥调节骨代谢的作用。然而，PTH具有小剂量、间断性促进骨形成，大剂量、连续性促进骨吸收的双向调节作用，这种特殊的作用使得PTH未达到理想中的效果。因此，值得进一步改进、优化PTH或甲状旁腺激素相关肽（PTHrP），甚至寻找更佳的骨形成促进剂。目前已有许多研究发现，不同剂量及使用方式所造成的不同效应跟PTH结合PTH1R后激活不同的信号通路有关。PTH1R是一种G蛋白偶联受体（GPCR），PTH与其相结合后激活的主要信号通路总结起来包括：（1）Gs／cAMP／PKA信号通路。（2）Gq／11／PLC／PKC信号通路。（3）nonPLC／PKC信号通路。（4）β－arrestin信号通路等。本文将对有关上述PTH调节骨代谢的4种主要信号通路内容及作用的研究进展进行综述总结。

Gs／cAMP／PKA信号通路

Gs／cAMP／PKA通路作为目前被研究最多的信号通路，是PTH调节骨组织代谢的主要机制。不同剂量及使用方式均会影响该通路下游分子的激活，从而产生不同的生物效应。间歇性PTH在成骨细胞和骨细胞中主要通过Gs／cAMP／PKA信号通路发挥其合成代谢作用。已知G蛋白是一种由α、β、γ3个亚基组成的三聚体蛋白。PTH与PTH1R结合后激活G蛋白α亚基Gs亚型。Gs进一步激活腺苷酸环化酶（AC）合成第二信使环磷酸腺苷（cAMP）。细胞内cAMP的一个主要靶点是蛋白激酶A（PKA），后者磷酸化一系列关键因子传递信号下行。首先，转录因子环磷酸腺苷效应元件结合蛋白（CREB）其Ser133被PKA及Ser129被糖原合酶激酶－3（GSK－3）磷酸化后激活，启动转录活动。同时，磷酸化的CREB刺激转录因子激活蛋白1家族（AP1）表达，如c－fos和c－jun，两者在骨形成及骨改建中发挥重要作用。PKA还能通过刺激3型胶原酶启动子磷酸化并激活RUNX2。转录因子RUNX2属于RUNX家族，负责一系列成骨相关基因转录，其靶基因包括细胞生长调节因子，如骨形态发生蛋白（BMP），胰岛素样生长因子（IGF），信号蛋白如Wnt蛋白，细胞外基质形成和血管生成调节因子等，进而促进成骨细胞分化成熟。RUNX2还能调节成骨细胞中抗凋亡基因Bcl－2和P21发生转录，抑制促凋亡基因Bad转录以及凋亡诱导因子CARP－1活性，从而使细胞凋亡受到抑制，成骨细胞数量得到增加。PKA及蛋白激酶C（PKC）均能作用于Raf，激活Raf／MEK／ERKMAPK信号通路，而RUNX2也可作为下游分子被细胞外调节蛋白激酶ERK1／2激活。最近，Thouverey等研究表明，间歇性PTH作用下，PKA也激活下游p38α丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），促进成骨细胞成熟与分化。成骨细胞中MAPK的缺失将显著削弱PTH的成骨作用。邱奕雁等还发现PKA可能促进共转录因子CITED1进入细胞核，促进成骨细胞骨钙素及碱性磷酸酶的表达，参与调节骨形成。

也有研究发现，间歇性PTH作用下Gs／cAMP／PKA信号通路介导的骨形成作用还与Wnt／β－catenin信号通路存在交联。Suzuki等研究表明，Gs／cAMP／PKA信号通路介导GSK－3β的磷酸化及失活作用，β－catenin降解受到抑制，进而胞质内积聚的β－catenin发生核转移，激活T细胞因子TCF／LEF，增强核内靶基因的转录和表达，以此促进成骨细胞成熟分化，并抑制其凋亡。Wan等还发现PKA能诱导Wnt／β－catenin信号通路内的低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）磷酸化，提高β－catenin稳定性而增加骨量。近年来，药物靶向治疗骨质疏松症成为新的研究热点。如于2019年被FDA批准用于治疗绝经后伴高骨折风险骨质疏松症的Romosozumab，为硬骨素（sclerostin）的IgG单克隆抗体。硬骨素是骨细胞中SOST基因编码的糖蛋白，其占据LRP5／6上Wnt蛋白结合位点，是典型的Wnt通路抑制剂。PTH间歇性使用可经Gs／cAMP／PKA信号通路抑制体内SOST基因表达，减少硬骨素合成，从而增加BMD值。此外，在成骨细胞中，PTH经Gs／cAMP／PKA信号通路还能抑制另一种Wnt通路抑制剂Dickkopf－1（Dkk1）的表达。但PTH经Gs／cAMP／PKA信号通路抑制SOST及Dickkopf－1表达的具体作用过程及详细机制尚不清楚，相应的基础研究仍需进一步展开。

然而，PTH激活Gs／cAMP／PKA信号通路经上述途径诱导成骨作用的同时，还影响核因子－κB受体活化因子配体（RANKL）／核因子－κB受体活化因子（RANK）／骨保护素（OPG）系统促进破骨细胞生成。RANKL由成骨细胞分泌，其与破骨细胞前体细胞表面的RANK受体结合后，激活核因子κB（NF－κB），诱导破骨细胞成熟分化。OPG是RANKL的诱导受体，与RANKL结合后，抑制RANK活化，从而减少骨吸收。Lee等通过细胞培养实验发现，连续性PTH激活Gs／cAMP／PKA信号通路，增强成骨细胞RANKL表达，导致RAN-KL／OPG比例上升，破骨细胞生成增加。Ricarte等进一步探究其中具体机制表明，PKA磷酸化其下游的盐诱导激酶SIK2／3，解除后者对CREB转录调节共激活因子CRTC2／CRTC3的磷酸化及失活作用，促使CRTC2／CRTC3发生核转位，从而增加RANKL表达。因此，在连续性、大剂量PTH作用下，破骨作用将强于成骨作用，最终发生骨吸收。鉴于上述机制，为了削弱PTH的骨吸收作用，最大化其促骨形成能力，Abaloparatide作为一种PTHrP，更加亲和PTH1R的RG构象，产生短暂信号反应，增强下游信号，发挥出比特立帕肽更强的成骨效果。但由于其作用机制同样为Gs／cAMP／PKA信号通路的激活，产生的骨吸收作用依然存在，这促使尝试寻找其他仅产生成骨作用的信号通路。

Gq／11／PLC／PKC信号通路

PTH与PTH1R结合后还激活G蛋白α亚基Gq及G11亚型。Gq／11促进磷酸脂酶C（PLC）催化磷脂酰肌醇4，5二磷酸（PIP2）水解形成第二信使肌醇三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。其中，IP3增加细胞内钙浓度，DAG进一步激活PKC。相较于AC，PLC的激活依赖更高浓度的激动剂或受体。目前认为Gq／11／PLC／PKC信号通路在骨骼中的主要功能为抑制成骨作用。

Guo等应用一种DSEL突变小鼠，该小鼠能表达突变的PTH1R，可以激活Gs／cAMP／PKA信号通路，但不能激活Gq／11／PLC／PKC信号通路。结果表明，与野生型小鼠相比，DSEL突变小鼠软骨化骨过程异常，表现为骨化延迟及软骨细胞增生，提示Gq／11／PLC／PKC信号通路在骨骺软骨细胞中的作用与Gs／cAMP／PKA信号通路相反，前者延缓软骨细胞增殖但加速软骨细胞分化。进一步体内实验发现，正常饮食时，DSEL突变小鼠骨量仅轻度减少，这提示Gq／11／PLC／PKC信号通路在骨代谢中的作用可能并不占主导地位。Ogata等建立了Gq基因过表达的转基因小鼠，发现该种小鼠松质骨和皮质骨均出现骨量丢失，表明Gq／PLC／PKC信号通路在骨发育和骨形成中的抑制作用。尽管研究也指出，Gq／PLC／PKC信号通路明显抑制成骨细胞的分化而非其增殖。进一步对Gq及G11基因双重敲除的小鼠予PTH注射治疗，结果显示其骨体积及骨转换均高于野生型小鼠，再次印证上述Gq／PLC／PKC信号通路的抑制作用。DelaCruz等采用类似实验，利用G11基因过表达的转基因小鼠证明了G11／PLC／PKC信号通路的激活将抑制骨形成。因此，Gq／11抑制剂的发现或合成有望成为未来抗骨质疏松药物研发方向之一。

最近，Li等建立去势雄性小鼠骨质疏松性骨折模型并间断性皮下注射hPTH（1－34）和一种PLC通路缺陷的PTHrP［GR（1－34）］，结果显示2周时两组骨折区域的骨密度及骨质量均有提升，但GR（1－34）组血清中抗酒石酸酸性磷酸酶及局部组织中破骨细胞数量均较少，这表明hPTH（1－34）激活的PLC通路能快速促进骨折区域破骨细胞生成，介导骨吸收作用。该研究还指出，4周时两组骨折愈合情况无显著差异。由于骨折愈合过程中骨吸收与骨形成相互伴随，虽然GR（1－34）组早期骨折区域骨吸收较慢较弱，骨形成也随之受到影响，但远期骨折愈合结果并未受到明显影响。此外，GR（1－34）相对较弱的骨吸收作用亦可作用于非骨折区域，促进非骨折区骨量增加。因此，PLC通路的阻断可为设计新的用于治疗骨质疏松性骨折的PTHrP提供思路。

nonPLC／PKC信号通路

PTH除了能激活上述两大常规信号通路外，研究发现其还能激活nonPLC／PKC信号通路。nonPLC／PKC是指PKC－δ的激活不依赖于PLC的激活。该条通路主要是由PTH（29－34）序列与PTH1R相互作用介导的。目前对于nonPLC／PKC信号通路的骨代谢作用已有不少研究，主要是基于GR（1－28）和GR（1－34）两种PTHrP来进行对比研究。GR（1－28）只能激活Gs／cAMP／PKA信号通路，而不能激活Gq／11／PLC／PKC以及nonPLC／PKC信号通路；GR（1－34）既能激活Gs／cAMP／PKA信号通路也能激活nonPLC／PKC信号通路，但不能激活Gq／11／PLC／PKC信号通路。通过调整两种PTHrP的比例使其产生相同的cAMP激活效应，那么两种PTHrP的唯一差别仅仅在于能否激活nonPLC／PKC信号通路。

体外实验中，Yang等利用上述PTHrP对前成骨细胞MC3T3－E1进行培养，结果证明GR（1－34）比GR（1－28）具有更强的促分化能力。这提示non-PLC／PKC信号通路的激活能促进成骨细胞分化，加快细胞成熟。此外，在长时间（48h）作用下，该通路的激活能抑制成骨细胞凋亡，但其凋亡抑制效应的相关机制尚不清楚。体内实验中，Yang等予C57BL／6J小鼠间断性皮下注射PTH（1－34）及前文所述的两种PTHrP，发现nonPLC／PKC信号通路的激活能加速骨小梁生长，显著增加小鼠胫骨骺板处骨小梁的数量及体积，并增加骨密度。Li等在上述基础上进一步探索发现，nonPLC／PKC信号通路的激活有助于重建骨小梁，增加骨痂量，进而加快去势小鼠骨质疏松性骨折愈合。这些实验共同证明了nonPLC／PKC信号通路在促进骨形成及骨折愈合中的重要作用。

然而nonPLC／PKC信号通路的具体内容及中介信号分子尚不完全清楚。最近，Tong等研究表明，nonPLC／PKC信号通路又可分为两种：一种与PTH（1－28）序列相关，且依赖PKA激活；另一种与PTH（29－34）序列相关，但不依赖PKA激活。两种non-PLC／PKC信号通路均能抑制成骨细胞凋亡，增强成骨细胞分化能力。鉴于此，特异性激活nonPLC／PKC信号通路（即上述第2种不依赖PKA激活的non-PLC／PKC信号通路）的PTHrP已成功合成，并初步证明其拥有与具备全信号通路的PTH（1－34）相当的成骨能力，但其分子量较小，且对破骨细胞的激活作用较弱。这种强成骨、弱破骨的作用优点对于抗骨质疏松症的治疗更为理想，而其小分子量的特点，有望改变既往PTH需皮下注射的使用方式。由于nonPLC／PKC信号通路的具体内容尚不完全明确，且特异性激活该信号通路的PTHrP缺乏更多的试验，因而需要更多的研究进行深入。

β－arrestin信号通路

与Gs／cAMP／PKA信号通路及Gq／11／PLC／PKC信号通路不同的是，β－arrestin信号通路发挥促骨形成作用不依赖G蛋白的激活。β－arrestin有β－arrestin1和2两种异构体。间歇性PTH作用下，β－arrestin2作为负调节蛋白与磷酸化的PTH1R结合形成复合体，阻止后者激活G蛋白，从而发挥受体脱敏作用。进而复合体被内吞降解，部分受体可通过再循环至细胞膜。这最终导致依赖G蛋白激活的相关通路如Gs／cAMP／PKA信号通路下行受到抑制，cAMP合成减少，成骨细胞活性下降，从而升高OPG／RANKL比值，减少破骨细胞生成，减弱骨吸收。此外，β－arrestin2发挥支架蛋白功能，与ERK1／2、p38及JNK结合并诱导PTH1R泛素化，激活MAPK信号通路，最终促进成骨细胞增殖与分化并抑制其凋亡。依赖G蛋白激活的PKA及PKC，其激活ERK1／2迅速但作用短暂，而β－arrestin信号通路介导的ERK1／2激活缓慢却持久，因而发挥的成骨作用时间更长。

bPTH（7－34）是一种特异性激活β－arrestin信号通路的PTHrP。Gesty－Palmer等动物实验研究表明，间歇性皮下注射PTH（1－34）和bPTH（7－34），两者均表现良好的促骨形成效应。由于β－arrestin信号通路独特的受体脱敏及内吞机制，不激活G蛋白从而不促进破骨吸收作用，因此，bPTH（7－34）与PTH（1－34）的不同点在于前者不引起血钙和骨吸收标志物的升高。或许，β－arrestin信号通路仅促进成骨而不增加破骨的作用特点在抗骨质疏松症治疗中更具优势。

展望

随着老龄化社会的发展，骨质疏松症的治疗显得愈加重要。特立帕肽作为最早及最广泛应用于临床的骨形成促进剂，在治疗骨质疏松症中占有重要地位，但值得进一步优化。目前对于PTH调节骨代谢的4条主要信号通路具体内容及作用机制已有不少研究，但仍存在许多未知部分，其中nonPLC／PKC信号通路具体机制尚不明确，具有更大的探索价值。期望更彻底地理解PTH激活的各条信号通路内容及机制，借此不断优化目前的PTH及PTHrP，抑或找寻新的靶向骨形成促进剂。SOST及Dickkopf－1单克隆抗体，作为新颖的靶向药物，在骨形成促进剂中别具一格；而特异性激活nonPLC／PKC信号通路以及特异性激活β－arrestin信号通路的PTHrP，因各自具备独特的优点，值得进一步开发及应用。

来源：中国骨伤2021年6月第34卷第6期

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