周海永，张传领，金百冶，浙江大学医学院附属第一医院泌尿外科，浙江医院泌尿外科，浙江萧山医院检验科

淋病是由淋病奈瑟菌( 淋球菌) 引起的性传播 疾病，在世界范围内广泛流行，每年新发感染患者达 到1. 06 亿，已严重影响人类的公共卫生安全。在我 国，淋球菌的治疗主要以广谱头孢菌素为主，如头孢 曲松、头孢克肟［1］。近年来，随着抗菌药物的广泛 使用，已经出现了对头孢菌素敏感性下降的淋球菌， 甚至出现了头孢菌素治疗失败的临床病例报 道［2-3］。各国研究人员均在寻找有效的抗菌疗法， 如联合疗法、替代药物、新药研发等。然而控制感染 的蔓延更是重中之重，不同地区感染淋球菌的型别 有所差异，NG-MAST 分型是基于测序技术的淋球菌 基因分型方法，通过具有高度变异性的 porB 基因 ( 编码孔蛋白) 和 tbpB 基因( 编码转铁结合蛋白) 测 序分析并与数据库比对后得到基因型，对于了解区 域感染淋球菌的分子流行特征及预防控制有一定的 意义。因此，本研究对本区域分离的淋球菌进行耐 药性分析及分子分型，报告如下。

1 材料与方法

1. 1 菌株收集 126 株淋球菌分离自2015 － 2016 年浙江萧山医院就诊的泌尿生殖道感染患者，男性 标本采自尿道分泌物，女性标本采自宫颈分泌物，剔 除同一患者中分离的重复菌株。所有菌株经过革兰 染色镜检、氧化酶试验以及 API NH 鉴定试剂条( 法 国 Bio-Merieux 公司) 鉴定为淋球菌，菌株保存于 20%甘油肉汤，置 － 80℃ 冰箱备用; 质控菌株 ATCC49226 由浙江大学医学院 Stijn 教授惠赠。

1. 2 仪器和试剂 GeneAmp PCＲ System 9600 为 美国 ABI 公司产品( Applied Biosystems) ，EPS-100 电泳仪为上海天能科技有限公司产品，UV-3B 紫外 成像仪为珠海黑马医学仪器有限公司产品; Premix Taq Version 2. 0 及 DNA Marker 购自宝生物工程( 大 连) 有限公司。引物合成及 PCＲ 扩增产物测序均由 上海生物工程有限公司完成。

1. 3 PPNG 检测 头孢噻吩纸片法检测 PPNG，根 据颜色的改变判断结果。

1. 4 药物敏感试验 琼脂稀释法检测淋球菌对青 霉素、四环素、大观霉素、环丙沙星、头孢曲松、头孢 克肟、阿奇霉素的最小抑菌浓度( MIC) ，按照 EUCAST 标准( http: / /www. eucast. org) 判断抗菌药物 敏感性，阿奇霉素 MIC≥256mg/L 被判定为高水平 耐药( AZ-HLＲ)［4］。

1. 5 DNA 提取 取 GC 培养基上纯培养的单个菌 落数个，混悬于 100μL 的无菌去离子水中，离心取 沉淀加入50μL 裂解液，100℃煮沸15min，冷却后以 14 000r/min 离心5min，取上清即为 PCＲ 扩增模板， －70℃保存备用。

1. 6 淋球菌多抗原序列分型( NG-MAST) 参照文 献报道［5］的方法，PCＲ 扩增 POＲ 和 TBPB 基因并测 序，然后将测序结果上传至 NG-MAST 数据库( http: / /www. ng-mast. net) ，比对获取菌株的 ST。

2 结果

2. 1 菌株分布 共收集126 株淋球菌，其中男性感 染者82 例，女性感染者 44 例，男女比例为 1. 86∶ 1; 年龄范围3 ～70 岁，平均( 33. 1 ±12. 8) 岁。

2. 2 PPNG 检测 126 株淋球菌中，检出 PPNG 菌 株72 株，总阳性率为 57. 14% ( 72/126) ，2015 年和 2016 年 PPNG 阳性率分别为64. 72%和48. 34%。

2. 3 药物敏感试验 126 株淋球菌对青霉素和四 环素耐药率较高( ＞ 65%) ，对阿奇霉素的耐药率较 低( ＜22%) ，未发现环丙沙星敏感的菌株和大观霉 素、头孢曲松、头孢克肟耐药的菌株( 表1) 。三重耐 药( 青霉素、四环素、环丙沙星) 淋球菌比例为 59. 52%( 75/126mg/L) ，所有阿奇霉素耐药菌株均 对青霉素、四环素、环丙沙星耐药，其中 AZ-HLＲ ( MIC≥256mg/L) 菌株22 株，占17. 46%。

2. 4 菌株 NG-MAST 分型 126 株淋球菌分为 82种不同的 STs 型别，其中 45 个为新发现的 STs。型 别较多的有 ST1866( 8 株) 、ST1927( 7 株) 、ST3102 ( 7 株) ，其余ST 型均小于5 株。22 株AZ-HLＲ 菌株 共有7 种不同的 STs，而所有的 ST3102 和 ST5309( 3 株) 均为 AZ-HLＲ 菌株，多数 ST1866( 6/8) 为 AZHLＲ 菌株。具体见表2( ≥3 株) 。

3 讨论

临床主要以抗菌疗法治疗淋病，最早以青霉素 治疗为主，但淋球菌易于获得外源耐药基因而产生 耐药性，自1976 年首次发现由质粒介导的产青霉素 酶的淋球菌( PPNG) 以来［6］，PPNG 菌株很快在全球 流行。本资料中 126 株淋球菌发现 PPNG 菌株 57. 14%，高于国内多个城市的报道［7］。随着国内抗菌药物的广泛使用，淋球菌的耐药性逐步增高，常 用于治疗淋病的抗菌药物如青霉素、四环素、喹诺酮 类已不适于治疗该类疾病。目前，我国和其他大多 数国家均将头孢菌素类( 头孢曲松、头孢克肟) 作为 治疗淋病的一线药物［1］。本资料也显示，淋球菌对 青霉素、四环素、环丙沙星的耐药率分别为 73. 02%、65. 08%、100． 00%，而未发现耐头孢曲松 和头孢克肟的菌株，说明头孢曲松和头孢克肟仍可 作为治疗淋病的首选药物，但仍要控制抗生素的使 用以防出现敏感性下降和治疗失败的情况。

随着淋球菌对头孢菌素的敏感性下降甚至多个 国家出现治疗失败病例报道以来［8］，淋球菌的抗菌 治疗越来越被重视，多重耐药淋球菌也将成为未来 治疗淋病的重大威胁。目前，欧洲和美国已将头孢 菌素和阿奇霉素联合用药作为标准指南治疗淋病; 然而，许多国家出现了阿奇霉素耐药的菌株，甚至对 阿奇霉素高水平耐药( AZ-HLＲ)［9-11］。笔者前期也 报道了两株高水平耐药的淋球菌［12］，英国更是出现 了8 例 AZ-HLＲ 淋球菌暴发的现象［13］。

目前，阿奇 霉素是临床治疗淋病的常用抗菌药物，但相对于头 孢菌素和大观霉素等，其对淋球菌的抗菌活性已处 于弱势，因此临床不建议单独使用。本研究资料显 示，126 株淋球菌中，多重耐药菌的比例为 59. 52%， 所有阿奇霉素耐药的菌株均对青霉素、四环素、环丙 沙星耐药，同时 21. 43% 的阿奇霉素耐药比例远高 于 WHO 推荐的用药标准( 耐药率 ＜ 5%) ，且 81. 48%( 22/27) 的菌株为 AZ-HLＲ，因此建议临床 治疗淋病时要慎用阿奇霉素，以防出现更大比例的 耐药现象。至于 AZ-HLＲ 菌株的耐药机制也有相关 报道，但本组的资料有待于进一步研究。 目前，国际上主要采用 NG-MAST 方法进行淋 球菌的传播及分子流行病学研究，关于ST 型别与耐 药相关性的研究也有报道［14］。本资料中 126 株淋 球菌分为82 种不同的 STs 型别，其中 45 个为新发 现的 STs，表明本研究中淋球菌的遗传背景存在高 度的多样性，可能与本地区人口流动性较强有关。 型别最多的有 ST1866 ( 8 株) 、ST1927 ( 7 株) 、 ST3102( 7 株) ，其余 ST 型均小于5 株。结合药物敏 感试验结果，除阿奇霉素外，未发现两者存在明显相 关性，可能与样本数量较少有关。22 株 AZ-HLＲ 菌 株共有7 种不同的 STs，而所有的 ST3102( 7 株) 和 ST5309( 3 株) 均为 AZ-HLＲ 菌株，多数 ST1866 ( 6/8) 为 AZ-HLＲ 菌株。国外报道［4］的与阿奇霉素 耐药淋球菌相关的 ST 型，如 ST1704、ST3158、ST2142 等在本资料中均未发现，而国内报道［15］的 ST1866 和 ST3356 中，笔者发现 6 株( 75． 00%) ST1866，且均为 HLＲ，ST3356 未发现。值得一提的 是，所有的 ST3102 和 ST5309 菌株均为 AZ-HLＲ，说 明本研究中 ST3102、ST5309 和 ST1866 型淋球菌都 可能和阿奇霉素的高水平耐药存在一定的相关性。

随着抗菌药物的广泛使用，淋球菌的耐药性不 容忽视，尤其头孢菌素敏感性降低及阿奇霉素高水 平耐药菌株的出现，预示着临床对于耐药淋球菌的 治疗将面临挑战。目前国内外均重视淋球菌耐药方 面的研究，本研究数据有限，但对本地区淋病的治疗 用药有一定参考价值。持续监测淋球菌对抗菌药物 的敏感性及分子流行特征，加强卫生安全的宣传及 教育对淋病的治疗及传播控制具有积极作用。

参考文献略。

来源：周海永,张传领,金百冶. 淋病奈瑟菌的耐药性及分子流行病学观察[J]. 中国皮肤性病学杂志,2018,32(12):1400-1403.

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