作者：海军军医大学第一附属医院创伤骨科 王彦军
肌腱是肌肉骨骼系统中一种柔韧致密的纤维结缔组织，其主要功能是在肌肉和骨骼之间传递力，在机体活动中发挥重要作用。肌腱损伤是一种临床常见的疾病，据统计全球每年有超过400万例新发肌腱损伤病例。当前，传统的肌腱修复方法，如保守治疗、单纯缝合、自体／同种异体／异种肌腱移植等，虽有一定疗效，但鲜有能完全恢复肌腱原始结构与功能的方法，新生肌腱往往愈合强度不足，此外由于肌腱血供不足且细胞数量稀少，受损肌腱的愈合通常需要长达12周的时间，而肌腱粘连等愈合不良并发症给患者带来巨大的痛苦，因此，如何加速并优化肌腱损伤的愈合过程，增加肌腱强度，减少粘连，一直是临床上面临的严峻挑战。组织工程技术的飞速发展，为组织缺损的治疗提供了新的思路与希望。通过在组织支架上负载种子细胞并利用生物信号调控肌腱再生的肌腱组织工程逐渐成为下一个有前途的修复技术，它通常包含了生物支架技术、细胞治疗技术，并利用适宜的化学或物理刺激。肌腱组织工程按再生过程可以分为体外组织工程与体内组织工程。体外组织工程指结合上述的组织工程三要素，在体外制造出新生肌腱，然后用外科手段将目的物移入体内。而体内组织工程则侧重于在生物体内直接促进肌腱的再生，它既可以利用预先负载于支架上的种子细胞，又可以利用肌腱自身或邻近组织迁移而来的细胞增殖分化，以实现肌腱的原位再生。
本文将结合当前常用组织工程肌腱实例，从组织支架的构建、种子细胞的选择、愈合相关生物信号调控策略、总结与展望等几个方面进行综述，以期深化对组织工程技术在肌腱损伤修复领域的理解，并为提出新的组织工程应用方案提供思考。
组织支架的构建
成熟而健康的肌腱具有多级分层结构，主要由平行、紧密排列的胶原纤维和少量细胞组成，这样的结构赋予了肌腱高度的各向异性，对于维持肌腱的机械强度至关重要。组织支架的构建包括材料的选择及构建方式两个方面。
支架材料的选择 可生物降解支架能随着组织愈合逐渐降解，无须二次手术移除，可以减少二次伤害。在肌腱组织工程领域，可生物降解支架因其独特的生物相容性和降解特性而备受重视，构建这些支架的材料包括天然材料和人工合成材料。由天然材料制作的组织支架包括天然聚合物支架及脱细胞天然支架。常见的天然聚合物包括多肽类（如胶原蛋白、
NING等开发了一种来自猕猴的新型脱细胞肌腱支架，证明了该支架支持外源性肌腱来源干细胞的增殖，并显著促进干细胞迁移和肌腱向分化。这种支架去除了细胞相关的免疫原性抗原，具有天然的生物相容性，并保留了一些生物力学特性，为种子细胞提供了完整的仿生环境。相较于天然材料，人工合成可降解材料展现出了更优秀的机械性能及可调控的降解性能。常见的包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸－羟基乙酸共聚物［PLGA］以及聚己内酯等。WU等将PLGA纳米纤维涂覆在聚乳酸纱线上，制备了具有良好对齐纳米纤维结构的混合纱线，其具有较强的失效载荷，并实现负载其上的胸腺素β－4持续缓慢释放28d，促进了干细胞生长、增殖和成腱基因表达。
天然材料与人工合成材料各有优劣，为了融合二者的优势，近年来研究多聚焦于开发基于这两类材料的复合支架。例如FARASATI等成功制备了壳聚糖／胶原／聚己内酯复合水凝胶薄膜支架，不仅机械性能适宜，还显著提高了生物相容性和细胞粘附性。CAI等制备了由左旋聚乳酸和丝素蛋白混合纺制成的静电纺纳米纤维纱线，并编织成组织支架，体外实验证明，加入丝素蛋白的支架显著促进了腱细胞增殖和表型维持。而体内实验显示，复合支架在手术后6个月显著促进跟腱再生，愈合肌腱结构得到改善。除此之外，响应性降解材料如响应性降解水凝胶、响应性降解塑料等，又是当前研究的热门方向之一，它是用于肌腱组织工程的一类新兴材料，可以通过各种内外刺激（包括机械刺激、温度、pH、氧化还原反应、光和磁场等）调控支架的降解速度，并且可以实现可控和持续地释放生物活性因子，这些新材料的应用，有力地推动生物支架的发展。
支架的构建方式 肌腱结构非常复杂，肌腱组织工程课题之一是创建能够模仿肌腱微观结构的三维支架。在支架的制造方式方面，静电纺丝、3D打印、湿法纺丝、熔融电写等新技术层出不穷，RASHID等设计的静电纺丝聚二恶烷酮和聚己内酯支架，
种子细胞的选择
成熟肌腱内细胞稀少，主要细胞类型为腱细胞。腱细胞是位于胶原蛋白纤维周围的成纤维样细胞，负责产生Ⅰ型胶原蛋白和其他相关的细胞外基质。理想的种子细胞应可以重新填充受伤的肌腱组织，最终目标是促进组织重建和功能恢复，腱细胞作为肌腱主体细胞天然可作为种子细胞。例如，ROB-BACH等用接种自体腱细胞的胶原蛋白支架修复绵羊大型肩袖缺损，结果显示与健康肌腱相比，修复的肌腱具有相似的厚度和宽度，具有较高的断裂应力和抗拉强度。但是由于肌腱中腱细胞数量少，供体肌腱不足等限制了其应用。为了克服这些局限性，真皮成纤维细胞（DFs）被作为替代来源，研究表明DFs可以表达肌腱调节基因和蛋白质，其产生的细胞外基质和腱细胞产生的成分相似。
RHEE等证明了透明质酸和DFs的组合对兔子肩袖损伤的愈合产生协同作用，愈合的肌腱表现出更高的胶原纤维密度和更好的胶原纤维连续性。腱细胞及DFs均为分化的细胞，与干细胞相比它们增殖能力有限，如今，可以分化为腱细胞的干细胞在肌腱组织工程中更具吸引力。骨髓间充质干细胞（BM－MSCs）是应用最广泛的干细胞类型，XIE等用含BM－MSCs的脱细胞肌腱支架修复兔子模型中的跟腱缺陷，结果显示支架促进了愈合过程中伤口部位I型胶原的再生，并改善了修复肌腱的力学性能。然而，BM－MSCs有获取过程痛苦，细胞数量少等局限性。
脂肪来源的干细胞（ADSCs）易于分离，可作为候选细胞类型，CHEN等将生长分化因子5诱导的ADSCs和纳米纱线支架组合，成功地生产了一种新的组织工程肌腱，其中的ADSCs显示出良好的细胞活力和肌腱相关标志物表达，并在兔子模型中显示出肌腱修复的潜力。肌腱来源的干细胞（TDSCs）是腱细胞的储备来源，其拥有自我更新和分化为腱细胞的能力，并释放信号以调节肌腱的形成和发育，与BM－MSCs相比，TDSCs在肌腱损伤修复方面更胜一筹，因为它们保留了一些肌腱组织特有的分化特性。ZHANG等将化学赋能的活性TDSCs嵌入生物相容性水凝胶支架中组成组织工程肌腱，异位肌腱再生模型中显示其促进了肌腱相关基因和蛋白质在体内的表达，在原位大鼠髌腱窗缺陷模型中显示其增强了肌腱的再生。除此之外，其他来源的干细胞也表现出应用的潜力，其中多能干细胞是最具可塑性的，其具有分化成体内所有细胞类型的潜能。KAJI等通过激活转化生长因子β和hedgehog通路从小鼠胚胎干细胞中诱导产生肌腱细胞，并由此生成了三维工程肌腱。NAKAJIMA等从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中衍生出腱细胞，并证明iPSCs衍生的腱细胞移植促进大鼠跟腱损伤后的运动功能恢复，再生肌腱的生物力学强度与健康肌腱的生物力学强度相当。羊膜来源的干细胞，可以从人或动物的胎盘羊膜中收集，与iPSCs一样可以避免与胚胎干细胞相关的伦理问题，包括羊膜上皮干细胞、羊膜间充质干细胞等均显示出肌腱分化能力及肌腱再生价值。尽管基于干细胞的肌腱组织工程具有巨大的应用前景，但成功与否取决于干细胞能否稳健有效地分化为成熟和功能性的腱细胞，另外还有畸胎瘤、异位骨化等发生的风险，因此这些干细胞的应用仍然具有挑战性。
肌腱愈合相关生物信号调控策略
肌腱损伤会触发一系列复杂的生物反应过程，旨在促进受损组织的修复与再生。肌腱愈合过程包括3个重叠的阶段，首先通常经过一个短暂的炎症期，持续约1周，然后是增殖期，持续数周，最后是重塑期，持续数月至数年。肌腱细胞或募集到受损区域的炎症细胞释放的细胞因子和生长因子通过诱导细胞增殖与分化、增加血管形成、促进细胞外基质合成和重塑，在肌腱愈合过程中起着关键作用。此外愈合过程还受其他生物活性因子（DNA、RNA和激素等）及物理刺激等调控。基于以上原理，肌腱组织工程可以利用这些生物调控信号以实现促进肌腱组织的再生。
既往研究已经证明了多种生长因子及细胞因子在肌腱愈合中的作用并在肌腱组织工程中得到应用。近年来，最常被提出的方法之一是同时使用几种生长因子，因为它们可能具有协同作用。例如：ZHOU等证明联合递送碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）可以显著促进肌腱细胞增殖及肌腱血管生成，最终促进肌腱愈合。此外富血小板血浆（PRP）因天然含有多种生长因子，且可以作为具有网状微观结构的三维生物活性支架而得到青睐。CHEN等将透明质酸和PRP注入聚己内酯外壳中用于兔屈肌腱断裂的修复，结果减少了肌腱周围粘连，加速了肌腱愈合。尽管生长因子在肌腱组织工程中得到广泛应用，但仍有一些问题需要解决，如生长因子容易降解，其具体使用的剂量，持续作用的时间，最佳的组合方案等仍需要进一步研究。
基因疗法已展现出了促进肌腱愈合的治疗潜力，它以基因载体作为媒介，将外部核酸（DNA或RNA）精确引入到特定的细胞中。引入的基因序列可以通过产生信号分子和转录因子，进而触发相关蛋白质的合成过程，持续促进愈合反应，比如ZHOU等通过引入生长因子相关基因，从而在损伤部位持续产生生长因子，来调控肌腱修复；HSIEH等通过慢病毒递送SCX（Scleraxis）基因进行改造的人骨髓间充质干细胞（hMSCs－Scx）表现出与原代人肌腱干细胞／祖细胞相似的愈合潜力。还可以通过干扰信使RNA（mRNA）转录，从而抑制细胞内相应蛋白质的翻译。CAI等利用Smad3－小干扰RNA（siRNA）纳米颗粒高效递送siRNA，实现对靶基因的沉默作用，以抑制成纤维细胞增殖并防止肌腱周围粘连。
外泌体是细胞外囊泡的关键亚型，由细胞膜向内出芽形成细胞内多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外形成。外泌体由体内各种细胞类型释放，直径30～100nm，携带大量细胞内的生物活性因子，包括DNA、mRNA、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和蛋白质、脂质等，以自分泌和旁分泌方式传递包裹其中的生物信号，参与许多生物过程。SONG等使用负载有来自肌腱干细胞外泌体（TDSCs－Exos）的可光聚合透明质酸支架来治疗大鼠模型中的肌腱缺损，结果显示用TDSCs－Exos治疗的大鼠在损伤部位有更好的纤维排列和组织学评分，此外损伤肌腱在生物力学测试中表现较好。尽管外泌体引起了组织工程的极大兴趣，但其功能机制仍不清楚。此外，由于外泌体分离和分析方法缺乏标准化，外泌体的临床使用受到限制。
由于肌腱承受力的特性，机械刺激被认为对于细胞增殖和分化及实现肌腱良好的机械性能发挥重要作用，对肌腱损伤后再生至关重要。机械刺激在肌腱组织工程中被广泛用于诱导肌腱分化，促进肌腱细胞外基质的沉积。例如，XU等对接种TDSCs的聚（L－丙交酯－co－ε－己内酯）／胶原支架施加机械拉力刺激，结果显示TDSCs增殖良好，肌腱相关基因和蛋白质阳性表达。支架植入裸鼠体内后，显示体内机械刺激下新肌腱形成质量高。YUAN等研发了一种基于明胶的坚韧水凝胶，其拉伸强度高达6．67MPa，将其直接缝合到成年兔断裂的肌腱上，通过补偿机械传导来刺激肌腱分化，使肌腱在8周内迅速恢复到初始状态。CHEN等揭示了机械刺激介导的胶原蛋白组装的时空复杂调控网络，其中PI3K－Akt和HDAC4可能是主要的信号通路。尽管相关研究已经取得了一些进展，但机械刺激激活肌腱再生的机制方面仍未完全阐明，需要更加深入的研究。
总结与展望
组织工程技术整合了材料工程学、细胞生物学和分子生物学，它涉及使用多种因素的组合来产生功能性结构。组织支架是作为新肌腱再生的骨架，基于肌腱复杂的结构特征，其应尽可能模拟肌腱组织的天然结构及其生物力学特性，为基质重塑和组织再生奠定基础。另外支架作为载体它允许负载用于肌腱再生的细胞及生物活性物质，如何发挥这些元素最大的组织再生能力是重要的研究课题，未来的探索应集中在发现细胞、生物信号和支架的最佳组合上，从而产生模仿天然无损伤肌腱的再生组织。见图1。
研究人员通过不断地探寻新型的生物材料、更为先进的制造技术、更适宜的种子细胞类型、以及可能产生积极影响的生物信号策略，以期在肌腱再生方面取得突破。这些年来，尽管许多组织工程支架已在动物肌腱损伤模型中取得了令人鼓舞的体内结果，但通往临床应用之路仍充满挑战。笔者坚信，随着研究的深入，肌腱组织工程支架终将成功应用于临床，为肌腱损伤患者带来更为理想的预后，从而造福广大患者。
来源：中国骨伤2024年11月第37卷第11期
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