作者：任 玲，郑博文，刘奕，中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院

在环境中，细菌以浮游状态和生物膜状态2种形式存在。与浮游细菌不同，生物膜中的细菌有独特的基因表达和代谢活动，能够抵抗抗生素、抗菌剂及宿主免疫系统的清除，当细菌以生物膜状态存在时，其对抗生素的耐药性为浮游状态的10 ~ 1000倍，从而引起临床上的持续性感染和慢性感染等问题。

口腔细菌生物膜是一种典型生物膜，是由需养和厌氧微生物组成的多物种微生物共同体，包括链球菌、放线菌及梭杆菌等，可引起龋病、慢性根尖周炎、牙周炎和种植体周炎等口腔疾病。自然界中的氨基酸，除了甘氨酸外，其余氨基酸都是α-氨基酸，存在L-氨基酸和D-氨基酸2种立体异构形式。虽然在自然界中L-氨基酸具有更高的丰度，是合成蛋白质的基础，但D-氨基酸参与微生物的新陈代谢，调节多种生理变化，如细胞壁的合成、孢子萌发及生物膜分散等。

细菌中的D-氨基酸可由消旋酶或差向异构酶通过催化可逆反应得到，也可由相应的α-酮酸通过转氨酶转化形成。研究发现，细菌在静止期可产生并向环境中释放0.01 ~ 3.00 mmol/L 的非典型D-氨基酸，在枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌的上清液中均发现了不同类型D-氨基酸，包括D-甲硫氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-苏氨酸及D-苯丙氨酸等。

Kolodkin-Gal等报道，在生物膜成熟后期可检测到D-氨基酸，且浓度为10 nmol/L的D-氨基酸混合物可阻止枯草芽孢杆菌生物膜形成，并促进已形成的生物膜离散。近年来，许多含有D-氨基酸的天然和合成肽都表现出良好的抗菌性能。D-氨基酸被认为是新型抗生物膜手段，但其生物学作用未完全确定。本文就D-氨基酸在口腔细菌生物膜中作用研究进展做一综述，为D-氨基酸的临床应用提供参考依据。

1. 生物膜

生物膜是指细菌被自身分泌的黏性胞外基质包裹，共同定植于生物（如牙龈）或非生物（如种植体）表面的细菌群落，生物膜基质由蛋白质、多糖及细胞外DNA等物质组成。生物膜形成的分子机制在不同种生物膜和不同位置存在较大差异，但多由细胞外基质构成，且其中胞外多糖和细胞外DNA在生物膜感染和逃避宿主免疫系统中发挥重要作用。

1. 1 生物膜的形成

生物膜的形成包括5个主要步骤。①起始附着：单个浮游细菌游动并通过其附属物（如菌毛和鞭毛）或其他物理因素（如范德华力和表面张力等）附着在表面，此时附着是可逆的。②细胞外基质和单层细胞形成：附着的细胞通过分泌胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）不可逆地附着在表面。③微菌落和多层细胞形成：细胞开始不断繁殖和聚集并形成微菌落，这些菌落通常包括多种类型的微生物，形成多层细胞结构，生物膜开始成熟。④生物膜的成熟：小菌落发展成大菌落，此时细胞密度最高，并形成孔隙和通道，相互融合形成成熟的三维结构。⑤生物膜分散期：生物膜中的微生物细胞快速繁殖并分散，生物膜中的细菌转变为浮游状态，以建立新的生物膜循环。

1. 2 生物膜对抗生素的耐药机制

生物膜的耐药机制十分复杂，目前研究表明，除了与浮游细菌共有的耐药机制以外，其还可能存在如下机制。①EPS在生物膜表面形成了一层生物屏障，EPS阻止抗菌剂扩散进入生物膜。②生物膜内由于氧气和营养受限，导致细胞生长、分裂、代谢缓慢，使细胞对抗生素的吸收减少而抵抗力增加。③在许多细菌中，抗生素耐药性是通过基因突变获得的，这种抗生素耐药基因可通过基因遗传和水平基因转移获得，而生物膜状态的细菌水平基因转移率远高于浮游细菌。④生物膜中存在持留菌，由于其生长速度缓慢或接近停止，大多数针对细胞分裂和细胞生长过程的抗生素对其无效，而一旦环境改变，这些细菌将再次引起感染。⑤细菌密度感应系统可通过调控生物膜形成或多重耐药外排泵提高细菌耐药性。不同物种生物膜的耐药机制存在一定差异，但不同微生物之间的耐药机制可相互影响，同时混合菌种生物膜的耐药性较单一菌种生物膜更强。

2. D-氨基酸对口腔细菌生物膜的作用

2. 1 D-氨基酸与变异链球菌

龋病是在以细菌为主的多因素作用下导致的一种慢性进行性破坏性疾病，其中变异链球菌作为主要致龋菌，其黏附于牙齿或修复体表面形成生物膜。抑制变异链球菌生物膜的形成或分解已形成的生物膜有助于预防和治疗龋病。目前研究发现，20 mmol/L D-亮氨酸、D-色氨酸不影响变异链球菌的生长，但能促进已形成的变异链球菌生物膜分解，使变异链球菌生物膜结构变得稀松、厚度减小，同时D-色氨酸能抑制生物膜的形成，且具有浓度依赖性。而D-组氨酸既可抑制变异链球菌的生长，同时可抑制变异链球菌生物膜的形成，可能是由于其可减少细菌胞外多糖的产生。

Tong等研究发现，D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸及三者混合物可显著提高乳酸链球菌素对变异链球菌的抗菌活性，抑制变异链球菌生长及生物膜形成，推测其原因是添加的外源性D-氨基酸影响细胞正常代谢，且抑制细菌自我修复乳酸链球菌素处理后形成的孔隙。此外，浓度为5.0 mmol/L的D-色氨酸与氯己定联合应用可使变异链球菌的最小生物膜抑菌浓度降低至单独应用氯己定的1/8，表明D-色氨酸可协助提高变异链球菌生物膜对氯己定的敏感性。

2. 2 D-氨基酸与粪肠球菌

临床中根管治疗失败主要是由于根管内或根尖外微生物未彻底清除，其中粪肠球菌是根管内持续感染、再感染及顽固性慢性根尖周炎的主要致病菌之一，其主要以生物膜的形式定植于根管系统，且在根管治疗时通过常规方法难以彻底清除，临床常用的根管冲洗液有次氯酸钠、氯己定、MTAD（a mixture of a tetracyclineisomer，an acid，and a detergent）等。

研究显示，适当浓度的D-甲硫氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸及其混合物均可抑制粪肠球菌生物膜的形成，其中D-甲硫氨酸、D-亮氨酸和D-色氨酸还具有离散已形成的粪肠球菌生物膜作用。Khider等采用等离子体聚合物包裹D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸混合物，在不影响D-氨基酸抑制粪肠球菌生物膜形成和离散已形成生物膜作用的情况下，可缓慢并持续释放D-氨基酸，以增强对持续性根尖周炎等疾病的疗效，具有临床转化前景。

Zilm等研究证明，D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-酪氨酸和D-色氨酸的混合物以剂量依赖性方式显著减少粪肠球菌生物膜的形成，同时在存在低于最小抑菌浓度的次氯酸钠或糊剂情况下，D-氨基酸混合物可显著减少粪肠球菌生物膜的形成。Li等研究发现，D-氨基酸混合物与万古霉素联合使用可促进生物膜的分散而增强杀菌能力，且具有浓度依赖性。

Liu等和Unsal等也发现，D-氨基酸混合物可作为杀菌增强剂，增强抗菌剂阻止生物膜形成和去除成熟生物膜的能力。可见，D-氨基酸与杀菌剂联合使用，或可成为降低根管治疗失败率和提高根管再治疗成功率的有效手段；而由于抗生素耐药性的出现，D-氨基酸在减少抗生素使用浓度方面的应用愈发重要，如何选择合适浓度的D-氨基酸与抗生素联合使用及其作用机制值得进一步研究。

2. 3 D-氨基酸与牙龈卟啉单胞菌

种植体周炎和牙周炎是造成种植体脱落和牙列缺损的主要原因，牙龈卟啉单胞菌是其主要致病菌，主要以菌斑生物膜的形式附着在种植体颈部或牙颈部表面。抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成并分散已形成的牙龈卟啉单胞菌生物膜是治疗种植体周炎和牙周炎的关键。然而，目前临床上并没有一种高效且能确保不损伤种植体或周围组织的方法，寻找不产生细菌耐药性并可增强对菌斑生物膜杀灭作用的生物制剂至关重要。

研究发现，D-缬氨酸可通过抑制牙龈卟啉单胞菌的活性和减少牙龈卟啉单胞菌胞外多糖的产生而抑制生物膜的形成并分散已成熟的生物膜，使生物膜结构松散，甚至无膜性结构形成，部分细菌形态由短杆状变为长杆状，推测其原因是外源性D-氨基酸的加入影响了细菌细胞壁肽聚糖的交联，使细菌细胞壁结构异常。同时，D-精氨酸、D-组氨酸和D-甲硫氨酸的混合物也被证实具有协同分散牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用，且具有良好的生物相容性。

谢丽丽等研究揭示，D-甲硫氨酸可能通过作用于环二鸟苷酸（cyclic diguanylate monophosphate，c-di-GMP）从而实现抑制和分散牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用，但c-di-GMP 的分子机制及上下游信号通路仍需进一步探究。3 结语D-氨基酸具有良好的药代动力学特性且无明显细胞毒性，为抑制和分散口腔细菌生物膜提供了新的治疗策略。Li等研究显示，各种细菌对不同类型D-氨基酸的敏感性存在差异，且部分D-氨基酸的单独抗菌作用有限，D-氨基酸之间联合作用或与抗生素联合作用抑制口腔细菌生物膜是否更加有效成为新的研究方向。

目前研究多局限于体外研究，在口腔复杂环境下，D-氨基酸是否可作为一种新型且高效的抗菌成分仍需进一步研究。未来的研究中应利用转录组学、代谢组学等技术的发展，揭示口腔细菌生物膜形成及与感染相关的基因位点，从机制层面提出清除口腔细菌生物膜的新方法。

来源：任玲,郑博文,刘奕.D-氨基酸在口腔细菌生物膜中作用研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2025,18(02):222-225+231.DOI:10.19538/j.kq.2025.02.015.

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