动物实验：本研究采用VSMC特异性SIRT2过表达腺相关病毒尾静脉注射ApoE⁻/⁻小鼠，4周后通过左颈动脉部分结扎联合高脂饮食8周建立易损颈动脉斑块模型。研究分为三组：Vehicle组、AAV-NC组、AAV-Sirt2组，每组6只。通过超声影像评估斑块形成，采用HE染色、Masson染色、油红O染色评估斑块形态，利用SA-β-gal染色联合α-SMA免疫组化检测VSMC衰老，通过免疫组化和免疫荧光检测SASP因子（MMP-2、IL-1β、TNF-α）及衰老标志物（P16、P21）表达。

细胞实验：分离原代小鼠VSMC，采用H₂O₂诱导VSMC衰老模型。通过慢病毒构建SIRT2过表达的VSMC，使用SIRT2特异性抑制剂AGK2和AMPK抑制剂BAY-3827进行干预。采用SA-β-gal染色评估细胞衰老程度，Western blot检测SIRT2、P16、P21、AMPK、p-AMPK、FOXO3a、p-FOXO3a蛋白表达，ELISA检测SASP因子（MMP-2、IL-1β、TNF-α）水平。

1. SIRT2过表达显著延缓小鼠颈动脉易损斑块形成

该研究首先利用VSMC特异性AAV9过表达SIRT2的小鼠易损斑块模型，评估SIRT2对斑块稳定性的影响。超声结果显示，AAV-Sirt2组小鼠颈动脉Vmax、IMT和EI均显著降低。病理染色进一步表明，SIRT2过表达使斑块总面积、脂质核心面积及脂质含量显著减少，而纤维帽面积、胶原含量及胶原/脂质比值显著增加。

图1：SIRT2 延缓小鼠易损斑块形成
A：实验时间线。B：左颈动脉长轴微超声代表性图像。C-E：Vmax（C）、IMT（D）和 EI（E）的定量分析。F：免疫荧光染色显示 SIRT2（红色）与α-SMA（绿色）共定位，箭头所指为SIRT2阳性的VSMC。G：VSMC中SIRT2表达水平的定量分析。

图2：SIRT2对小鼠易损斑块及VSMC的影响
A：颈动脉整体及其横切面的代表性显微图像，分别进行HE、Masson三色和油红O染色。B：SA‑β‑gal 染色（蓝色）联合α‑SMA免疫组化（棕色）的代表性图像。蓝色为衰老细胞，棕色为 VSMC，两者共定位即表示衰老的VSMC。C-I：动脉粥样硬化病变面积（C）、纤维帽面积占比（D）、脂质核心面积占比（E）、纤维帽/脂质核心比值（F）、胶原含量（G）、脂质含量（H）以及胶原/脂质比值（I）的定量结果。J：衰老VSMC比例的定量分析。

2. SIRT2过表达显著延缓VSMC衰老

SA-β-gal染色联合α-SMA免疫组化显示，AAV-Sirt2组斑块内衰老VSMC比例显著降低。免疫组化结果显示，SASP因子（MMP-2、IL-1β、TNF-α）水平显著下降。免疫荧光双染进一步证实，AAV-Sirt2组VSMC中衰老标志物P16和P21表达显著降低。

图3：SIRT2对易损斑块内VSMC的SASP因子及衰老标志物的影响
A：MMP‑2、IL‑1β和TNF‑α免疫组化代表性图像。B-D：MMP‑2（B）、IL‑1β（C）和 TNF‑α（D）阳性面积占斑块总面积百分比的定量分析。E：免疫荧光染色显示P16（红色）与α‑SMA（绿色）共定位，箭头指示P16阳性的VSMC。F：VSMC中P16表达的定量分析。G：免疫荧光染色显示P21（红色）与α‑SMA（绿色）共定位，箭头指示P21阳性的VSMC。H：VSMC中P21表达的定量分析。

在体外H₂O₂诱导的VSMC衰老模型中，SIRT2过表达同样减少了衰老VSMC数量，降低了P16、P21及SASP因子水平；而SIRT2特异性抑制剂AGK2则进一步加重VSMC衰老。

图4：SIRT2对原代VSMC衰老的影响
A、G：各实验组SA‑β‑gal染色的代表性图片。B、H：衰老VSMC比例的定量分析。C、I：Sirt2、P16、P21及β‑actin的Western blot结果。D-F、J-K：以β‑actin为内参，对Sirt2（D）、P16（E、J）和 P21（F、K）表达的定量分析。L-Q：ELISA检测TNF‑α（L、O）、MMP‑2（M、P）和IL‑1β（N、Q）的浓度。

3. SIRT2通过AMPK/FOXO3a通路调控VSMC衰老

机制研究发现，SIRT2过表达显著增加VSMC中AMPK和FOXO3a的磷酸化水平；而AMPK特异性抑制剂BAY-3827可逆转SIRT2的抗衰老效应。提示SIRT2通过激活AMPK/FOXO3a通路延缓VSMC衰老。

图5：SIRT2通过AMPK/FOXO3a通路调控VSMC衰老并延缓易损斑块形成
A、C：小鼠颈动脉中p‑AMPK（A）或 p‑FOXO3a（C）（红色）与α‑SMA（绿色）共定位的免疫荧光代表性图像。箭头指示p‑AMPK或p‑FOXO3a阳性的VSMC。B、D：VSMC中p‑AMPK（B）和p‑FOXO3a（D）表达水平的定量分析。E、J：各实验组 AMPK、p‑AMPK、FOXO3a、p‑FOXO3a 及β‑actin的Western blot结果。F-I、K-N：AMPK（F、K）、p‑AMPK（G、L）、FOXO3a（H、M）和 p‑FOXO3a（I、N）表达的定量分析。

4. 白藜芦醇通过SIRT2-AMPK-FOXO3a轴延缓VSMC衰老

与H₂O₂组相比，白藜芦醇（RESV）处理组SIRT2蛋白水平显著升高，AMPK和FOXO3a磷酸化增强，衰老VSMC比例减少，P16、P21表达及SASP因子水平显著降低。而联合使用SIRT2抑制剂AGK2后，白藜芦醇的保护作用被部分逆转。上述结果表明，白藜芦醇以SIRT2依赖性方式延缓VSMC衰老。

图6：白藜芦醇以 SIRT2 依赖性的方式减轻VSMC衰老
A：各实验组SA‑β‑gal染色代表性图片。B：衰老VSMC比例的定量分析。C：Sirt2、P16、P21 及β‑actin 的 Western blot 结果。D-F：Sirt2（D）、P16（E）和 P21（F）表达的定量分析。G-I：ELISA 检测 TNF‑α（G）、MMP‑2（H）和 IL‑1β（I）的浓度。J：AMPK、p‑AMPK、FOXO3a、p‑FOXO3a 及 β‑actin 的 Western blot 结果。K-N：AMPK（K）、p‑AMPK（L）、FOXO3a（M）和 p‑FOXO3a（N）表达的定量分析。

综上，该研究揭示了SIRT2-AMPK-FOXO3a信号轴在调控VSMC衰老及延缓易损斑块形成中的核心作用。

图7：SIRT2调控VSMC衰老延缓易损斑块形成的机制示意图

1. 首次在VSMC特异性过表达SIRT2的小鼠易损斑块模型中，系统阐明SIRT2对VSMC衰老及斑块稳定性的调控作用。

2. 首次揭示SIRT2通过AMPK/FOXO3a信号通路延缓VSMC衰老，进而增强斑块稳定性的分子机制。

3. 首次证实白藜芦醇通过SIRT2-AMPK-FOXO3a轴发挥抗VSMC衰老作用，为靶向SIRT2的药物筛选提供了理论依据。

本研究发现，VSMC特异性过表达SIRT2可显著延缓VSMC衰老，增强斑块稳定性，其机制主要通过AMPK/FOXO3a信号通路实现。白藜芦醇通过SIRT2-AMPK-FOXO3a轴延缓VSMC衰老。该发现揭示了SIRT2作为VSMC衰老关键调控因子的新功能，为延缓易损斑块进展及预防ACS提供了新的治疗靶点。

需要指出的是，本研究尚缺乏人体易损斑块组织的直接验证，未来仍需开展前瞻性、多中心临床研究，进一步明确SIRT2的临床转化潜力。

吴小凡教授团队表示，未来将继续围绕SIRT2调控血管衰老、斑块稳定性及ACS机制开展系列研究，进一步推动新型靶点的识别和冠心病精准防治。