炎症性肠病 (inflammatory bowel disease，IBD) 是一类由黏膜免疫异常、遗传易感性及肠道微生态失衡共同驱动的慢性炎症性疾病。近年来，除细菌菌群外，肠道真菌及其诱导的免疫反应也被认为参与克罗恩病 (Crohn’s disease，CD) 的发生发展。白色念珠菌 (Candida albicans) 广泛定植于人体口腔和肠道，是诱导人类黏膜Th17细胞反应的主要共生真菌之一。稳态条件下，白色念珠菌反应性Th17细胞通过分泌IL-17A和IL-22维持黏膜屏障完整性，并限制真菌侵袭；但在炎症微环境中，部分Th17细胞可进一步表达IFN-γ、GM-CSF和IL-21等炎症因子，转变为具有致病潜能的效应细胞。既往研究发现，CD患者外周血中白色念珠菌反应性CD4⁺ T细胞增加，肠黏膜中也可见IL-17A⁺IFN-γ⁺ T细胞富集。然而，这些Th17细胞具体识别哪些真菌抗原、主要在哪一黏膜部位形成和维持，以及CD肠道中的致病性Th17细胞是局部新产生的免疫反应，还是既有稳态克隆在炎症环境中发生功能重编程，仍不明确。因此，本研究从抗原特异性、口腔—肠道克隆联系及炎症性功能转化三个方面，解析白色念珠菌反应性Th17细胞在稳态和CD中的来源与功能变化。

为明确白色念珠菌诱导的Th17反应是否具有特异性，研究人员先用白色念珠菌及多种近缘酵母刺激健康者外周血细胞，结合抗原反应性T细胞富集、流式细胞术和单细胞克隆培养，比较不同真菌诱导的T细胞频率、细胞因子表达、功能亲和力及交叉反应。在此基础上，根据白色念珠菌细胞外囊泡和生物膜的蛋白质组数据筛选23种候选蛋白，再利用覆盖蛋白全长的重叠肽池进行刺激，以确定Th17细胞识别的主要抗原。明确抗原特异性后，研究进一步分析这些细胞的组织来源。通过比较皮肤、口腔和肠道中白色念珠菌反应性T细胞的丰度及归巢分子表达，判断其可能的主要储存部位；随后在配对的血液、口腔和肠道样本中开展单细胞RNA和TCR测序，追踪不同黏膜组织间共享的T细胞克隆。口腔与粪便来源白色念珠菌的全基因组测序，则用于判断两处是否存在遗传相近的菌株。最后，研究者通过肽池刺激和TCR克隆匹配，判断CD患者中的白色念珠菌反应性Th17细胞是否保留原有的抗原识别谱；同时结合单细胞转录组、基因集富集、SCENIC转录调控网络和RNA velocity分析，比较其在口腔与炎症肠道中的功能状态，并推测潜在的状态转换方向。

➤白色念珠菌特异性诱导人Th17细胞应答

白色念珠菌能否诱导不同于其他近缘酵母菌的Th17细胞应答，是研究首先关注的问题。研究者比较了健康者外周血中针对多种酵母菌的记忆CD4⁺ T细胞，发现这些真菌均可引起一定程度的记忆性T细胞反应，但白色念珠菌诱导的CD154⁺记忆T细胞数量最多。进一步分析细胞因子后发现，IL-17A和IL-22主要由白色念珠菌反应性细胞产生，而其他酵母菌诱导的T细胞则更多表达IFN-γ，呈现出偏向Th1的特征。值得注意的是，即使是与白色念珠菌基因组高度相似的都柏林念珠菌，也只能诱导较弱的Th17应答。这表明，强烈诱导Th17细胞并不是念珠菌属共有的特征，而是白色念珠菌较为独特的免疫效应。

这种特异性是否意味着Th17细胞只能识别白色念珠菌，而不能识别其他近缘真菌？单细胞克隆实验显示，产生IL-17A的T细胞克隆很少对其他念珠菌发生交叉反应；相比之下，产生IFN-γ的克隆可以识别多种近缘酵母菌。两类细胞之间的TCR克隆重叠度也很低，进一步说明它们并非由同一批T细胞分化而来。综合这些结果，白色念珠菌诱导的Th17应答具有较强的物种特异性，而针对同一种真菌形成的Th17和Th1应答，很可能分别由不同的抗原或表位驱动。

Fig 1. 白色念珠菌选择性诱导具有较强物种特异性的人Th17细胞反应

➤白色念珠菌反应性Th17细胞主要识别细胞外囊泡中的少数蛋白

白色念珠菌含有数千种蛋白，但其诱导的Th17细胞究竟是广泛识别多种真菌成分，还是集中识别少数特定抗原仍不清楚。研究者比较了完整菌体裂解物、分泌组分和细胞外囊泡诱导的CD4⁺ T细胞应答。三类抗原诱导的反应性CD4⁺ T细胞频率总体相近，但分泌组分和细胞外囊泡诱导的细胞中，记忆表型比例更高，IFN-γ表达更低，因而呈现更高的Th17/Th1反应比值。这一结果提示，细胞外囊泡可能携带了诱导白色念珠菌特异性Th17应答的主要抗原。

随后，研究者根据细胞外囊泡和生物膜的蛋白质组数据筛选出23种候选蛋白，并使用覆盖蛋白全长的重叠肽池逐一检测T细胞反应。结果显示，只有其中少数蛋白能够明显诱导IL-17A和IL-22产生，而其他蛋白更倾向于引起IFN-γ反应。进一步分析发现，这些能够诱导Th17应答的蛋白在细胞外囊泡中明显富集。将其组合成肽池后，所引起的Th17反应已接近完整白色念珠菌裂解物，白色念珠菌反应性Th17细胞克隆也主要识别这一组蛋白。由此可见，人类针对白色念珠菌的Th17应答并非分散于大量真菌成分，而是集中于少数富集在细胞外囊泡中的特定优势蛋白。

Fig 2. 白色念珠菌反应性Th17细胞主要识别富集于真菌细胞外囊泡中的少数蛋白

➤白色念珠菌反应性Th17细胞主要富集于口腔黏膜

在明确白色念珠菌反应性Th17细胞所识别的抗原后，研究者进一步追踪这些细胞可能主要分布于何种组织。外周血分析发现，这类Th17细胞普遍高表达CLA，而肠道归巢分子整合素β7的表达较低。相比之下，针对多种肠道细菌的Th17细胞主要表达整合素β7，而针对皮肤相关微生物的细胞则更多表达CLA。这种归巢特征提示，白色念珠菌反应性Th17细胞可能并非主要在肠道中形成。

不同组织中的T细胞分布进一步支持了这一判断。皮肤来源的CD4⁺记忆T细胞以CLA表达为主，肠道细胞则主要表达整合素β7；口腔黏膜中的T细胞较为特殊，不仅表达CLA，部分细胞还同时表达整合素β7，提示其可能具备在不同黏膜部位间迁移的能力。随后，研究者直接比较皮肤、口腔、回肠和结肠来源T细胞对白色念珠菌的反应，发现口腔黏膜中的反应性细胞明显更多。综合归巢表型和组织反应性结果，口腔黏膜是稳态下白色念珠菌反应性Th17细胞的主要储存部位，并可能参与这些细胞的诱导或长期维持，但目前尚不能确定其最初的免疫启动部位。

Fig 3. 白色念珠菌反应性Th17细胞高表达CLA，并主要富集于口腔黏膜

➤白色念珠菌反应性Th17细胞连接口腔与肠道免疫

口腔黏膜中富集白色念珠菌反应性Th17细胞，但这些细胞是否仅停留在口腔，还是也分布于肠道，仍需进一步确认。研究者对健康者配对的外周血、口腔和肠道样本进行了单细胞RNA测序和TCR测序，并利用血液中已确定的白色念珠菌反应性TCR，在组织样本中追踪相同的细胞克隆。结果显示，口腔CD4⁺记忆T细胞中Th17细胞所占比例较高，部分供者中，白色念珠菌反应性克隆可占全部口腔TCR克隆的15%，在Th17细胞群中甚至达到27%。虽然肠道中的相应细胞比例较低，但研究者在口腔和肠道中检测到了相同的TCR序列，且这些共享克隆主要分布在Th17细胞群中。进一步分析发现，在口腔与肠道共有的TCR克隆中，约42%能够识别白色念珠菌；若仅分析共享的Th17克隆，这一比例升至77%。这说明白色念珠菌是推动口腔与肠道Th17克隆重叠的重要抗原来源。

与此同时，配对口腔和粪便样本中的白色念珠菌分离株具有较高的遗传相似性，提示同一或相近菌株可能同时存在于两个部位。综合来看，口腔和肠道并非彼此独立的免疫空间，白色念珠菌反应性Th17细胞构成了连接两处黏膜的重要克隆群体。不过，这些结果只能证明两处存在共享克隆，尚不能确定细胞迁移的具体方向。

Fig 4. 白色念珠菌反应性Th17细胞富集于口腔黏膜，并在口腔与肠道间共享TCR克隆

➤CD肠道中的白色念珠菌反应性Th17细胞呈现致病性特征

明确这些细胞在口腔与肠道之间存在克隆联系后，研究进一步关注它们在CD中的状态变化。外周血分析显示，与健康对照相比，CD患者中白色念珠菌反应性CD4⁺ T细胞明显增多，IL-17A⁺和IFN-γ⁺细胞的绝对数量均有所增加。不过，反应性T细胞中IL-17A⁺细胞所占比例并未明显改变，说明疾病中的变化更可能来自相关细胞群体的扩增，而不是整体向Th17表型偏移。

随后，研究者利用TCR序列在肠道组织中识别白色念珠菌反应性细胞，并比较健康者与CD患者的转录特征。患者肠道中的这类Th17细胞明显富集炎症反应、IFN-α/IFN-γ反应及致病性Th17相关基因，IFNG、IL21、GZMA和GZMB等基因的表达也随之升高。进一步分析发现，它们并非处于单一状态，而是可分为相对稳态的Th17.1细胞和炎症特征更明显的Th17.2细胞。前者主要表达IL22和TGFB1，后者则高表达IFNG、CSF2、IL21和IL12RB2，并呈现BHLHE40、TBX21等致病性调控程序。RNA velocity分析推测，这些细胞可能沿着中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、Th17.1到Th17.2的方向逐步变化。在这一过程中，TCF7和LEF1等稳态相关基因逐渐降低，而多种炎症效应基因持续升高。由此提示，白色念珠菌反应性Th17细胞进入CD炎症肠道后，部分细胞可由相对稳态的状态转向更具致病潜能的效应状态。

Fig 5. 白色念珠菌反应性Th17细胞在CD肠道中呈现致病性特征

➤CD中的致病性Th17细胞可能来源于既有的稳态克隆

前面的结果表明，CD肠道中的部分白色念珠菌反应性Th17细胞呈现出致病性特征。接下来需要明确的是，这些细胞是否在炎症环境中重新识别了新的真菌抗原。研究发现，CD患者的Th17细胞仍主要识别此前确定的少数Th17相关蛋白，其抗原范围与健康者基本一致；同时，这些细胞继续高表达CLA，而肠道归巢分子整合素β7的表达较低。也就是说，疾病状态虽然改变了细胞的功能，却没有明显改变其原有的抗原特异性和归巢特征。在肠道组织中，炎症区域的CLA⁺ CD4⁺ T细胞明显增多，并且其比例与白色念珠菌Th17靶蛋白反应强度呈正相关，提示这类细胞可能由外周或其他黏膜部位进入炎症肠道。进一步比较口腔与肠道样本后发现，CD患者口腔中的白色念珠菌反应性Th17细胞仍保持相对稳态的转录特征，而肠道中的部分同类细胞则呈现明显的致病性程序。更关键的是，两处组织中的细胞共享部分TCR克隆，其中也包括肠道内的致病性Th17细胞。这些结果不支持炎症肠道内大量产生全新抗原特异性的模型，而更符合另一种解释：既有的白色念珠菌反应性稳态克隆发生扩增和跨组织分布，部分细胞进入炎症肠道后获得致病性转录特征。口腔与肠道共享TCR支持其具有共同克隆来源，但尚不能直接确定细胞迁移的方向和过程。

Fig 6. CD肠道中的白色念珠菌反应性CLA⁺ Th17细胞保留抗原特异性，并与口腔共享TCR克隆

本研究提示，白色念珠菌反应性Th17细胞主要识别少数富集于细胞外囊泡中的蛋白，稳态下主要存在于口腔黏膜，但口腔与肠道之间可共享相同的T细胞克隆。在CD患者中，这些细胞仍保留原有的抗原特异性，却在炎症肠道中获得IFN-γ、GM-CSF和IL-21等致病性特征，提示既有的稳态Th17克隆可能在局部发生功能重编程。这一结果为抗IL-17治疗在CD中疗效有限、甚至可能加重疾病提供了一种可能的机制解释：IL-17阻断可能同时削弱黏膜保护性抗真菌免疫，却未必阻止Th17细胞向IFN-γ、GM-CSF和IL-21等炎症效应程序转化。