白塞病（BD）是一种慢性、复发性、多系统受累的血管炎性疾病，以口腔溃疡、生殖器溃疡、眼部炎症及血管病变为主要表现。BD的病理特征之一是中性粒细胞的异常活化及血管内皮功能障碍，故被认为是一种中性粒细胞性血管炎。尽管近年来对BD免疫病理机制的认识不断深入，天然免疫失调如何具体驱动血管损伤仍未完全阐明。CD177是一种主要表达于中性粒细胞表面的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，在健康对照者中约占循环中性粒细胞的45%~60%，在炎症性肠病、ANCA相关性血管炎等疾病中显著升高，但其在BD中的作用尚不明确。本研究旨在探讨CD177阳性中性粒细胞在BD中的表达特征及其通过中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）调控血管内皮细胞衰老进程的机制。
本研究纳入38例活动期BD患者及30例健康对照，采用流式细胞术、RNA测序、质谱分析、免疫荧光、免疫组化、酶联免疫吸附试验等多种方法，系统分析了BD患者外周血及血管组织中CD177+PMN的分布、NETs生成能力及其对血管内皮细胞（VECs）衰老的影响。研究还通过使用重组组蛋白、Toll样受体（TLR）抑制剂及衰老细胞清除药物等干预手段，进一步探索了分子机制。CD177+PMN在BD中显著扩增并与疾病活动度相关研究首先通过重新分析已有的BD外周血中性粒细胞转录组数据（GSE205867），发现BD患者中性粒细胞中CD177表达显著升高（差异倍数=4.8，p<0.0001，图1A）。流式细胞术验证显示，活动期BD患者外周血中CD177+PMN比例显著高于健康对照组（p<0.0001，图1C），且在胃肠道及血管受累的系统性BD患者中更为明显（图1D）。CD177+PMN比例与C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）及BD疾病活动评分（BDCAF）呈正相关（图1E、1F、1H），并在临床缓解后显著下降（图1G）。免疫组化显示，BD患者主动脉壁中CD177+PMN浸润显著增多（图1I-1J）。上述结果表明，CD177+PMN在BD中扩增并可作为疾病活动的潜在生物标志物。图1：BD CD177+中性粒细胞扩增并与临床特征相关
BD CD177+PMN表现出增强的NETs生成与氧化磷酸化水平
为进一步明确BD CD177+PMN的功能特征，研究对7例未经治疗的BD患者及7例健康对照的CD177+PMN进行了RNA测序。结果显示，BD CD177+PMN中336个基因上调、187个基因下调，基因集富集分析（GSEA）提示NETs形成及活性氧（ROS）通路显著激活（图2A-2B）。实验验证表明，无论是静息状态还是PMA刺激下，BD CD177+PMN生成的NETs（MPO与DAPI共定位）及细胞内ROS水平均显著高于健康对照（p<0.0001，图2C-2F），且BD CD177+PMN的NETs生成能力高于BD CD177-PMN。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸可显著抑制NETs形成（图2C-2F）。此外，钙离子载体A23187和离子霉素刺激下，BD CD177+PMN仍显示出更强的NETs释放能力。以上结果说明BD CD177+PMN处于高度活化状态，具备增强的NETs生成能力。图2：BD CD177+中性粒细胞中ROS和NETs生成增强BD CD177+PMN来源的NETs诱导血管内皮细胞衰老研究进一步将BD及健康对照来源的CD177+PMN产生的NETs处理VECs。结果显示，BD CD177+PMN来源的NETs显著上调VECs中IL-6、CXCL8、TNF及ICAM-1等炎症因子和黏附分子的表达（图3A），即使经DNase I消化后，IL-6、CXCL8、ICAM-1仍维持高表达（图3A）。RNA测序分析提示，BD NETs刺激的VECs中衰老、衰老相关分泌表型（SASP）及p53通路显著激活（图3B）。实验验证显示，BD NETs处理组VECs的SA-β-gal染色阳性率显著升高（p<0.0001，图3C-3D），培养上清中IL-6、CXCL8、ICAM-1水平升高（图3E），p21和p53蛋白表达上调（图3F-3G），且在去除刺激后增殖能力持续丧失。BD患者主动脉壁中p21、p16表达升高，Ki67阳性率下降（图3H-3I）。进一步发现，SASP中CXCL8可促进中性粒细胞趋化，这一作用可被抗CXCL8抗体阻断（图3K）。衰老细胞清除药物达沙替尼+槲皮素（Dasatinib+Quercetin，D+Q）可抑制NETs诱导的SASP及中性粒细胞趋化（图3J-3K）。以上结果表明，BD CD177+PMN来源的NETs通过诱导VECs衰老形成促炎正反馈环路。图3：BD CD177+中性粒细胞来源的NETs促进内皮细胞衰老
NETs中富集的组蛋白H3.1通过TLR4介导内皮细胞衰老为鉴定NETs中促进衰老的关键蛋白，研究对BD及健康对照CD177+PMN来源的NETs进行了质谱分析，共鉴定出2439种蛋白，其中39种上调、14种下调（图4A）。组蛋白H3.1（Histone H3.1）为上调最显著的蛋白之一（log2差异倍数=1.82）。功能实验显示，H3.1可显著诱导VECs衰老及SASP（SA-β-gal阳性率升高，p21、IL-6、CXCL8、ICAM-1表达上调），而H3.2无此作用。H3.1的中和抗体可阻断BD NETs诱导的VECs衰老。TLR4抑制剂（TAK242）可显著抑制H3.1诱导的VECs衰老、SASP及p21/p53表达（图4B-4G），而TLR2抑制剂（C29）无效。转录因子富集分析提示C/EBPβ可能在其中发挥关键调控作用。D+Q处理同样可减轻H3.1诱导的SASP及中性粒细胞趋化（图4H-4J）。以上结果证实，BD CD177+PMN来源的NETs中富集的H3.1通过TLR4信号通路诱导VECs衰老。
图4：BD CD177+中性粒细胞来源的NETs中富集的H3.1促进血管内皮细胞衰老本研究系统揭示了BD患者中CD177+PMN亚群显著扩增，其通过分泌富含组蛋白H3.1的NETs，激活VECs表面的TLR4受体，诱导内皮细胞衰老及SASP，进而通过CXCL8招募更多中性粒细胞，形成炎症正反馈环路，促进BD血管炎进展。靶向NETs-H3.1-TLR4轴或使用衰老细胞清除药物（如D+Q）可能为BD提供新的治疗策略。本研究将CD177+PMN与内皮细胞衰老关联，拓展了对BD血管炎机制的理解。尽管既往研究已提出BD中中性粒细胞功能异常，但具体致病亚群一直未被明确。低密度粒细胞在BD中仅占循环中性粒细胞的1%~5%，其系统性炎症贡献有限。而本研究关注的CD177+PMN在BD外周血中占比显著升高（可超过77.5%），且与疾病活动度、严重程度及血管病变密切相关，提示其可能是BD中真正发挥主导作用的致病性中性粒细胞亚群。这一发现与CD177在ANCA相关性血管炎、系统性红斑狼疮等疾病中的致病作用一致，但也需注意在炎症性肠病中CD177+PMN可能具有保护作用，提示CD177+PMN的功能可能具有疾病特异性。NETs在BD中的作用已被初步认识，但以往研究多聚焦于其促凝或诱导内皮凋亡效应。本研究首次发现NETs可诱导内皮细胞进入衰老状态。细胞衰老并非静止过程，衰老细胞通过分泌SASP因子（如IL-6、CXCL8、ICAM-1）重塑局部微环境，招募免疫细胞，加剧炎症。本研究中，衰老VECs上清可显著促进中性粒细胞趋化，且这一效应可被抗CXCL8抗体阻断，证实了“NETs-内皮衰老-中性粒细胞招募”正反馈环路的存在。这一机制在BD主动脉壁组织中也得到了验证（p21、p16升高，Ki67降低）。机制上，本研究通过质谱鉴定出H3.1是BD CD177+PMN NETs中富集最显著的上调蛋白，并证明H3.1通过TLR4而非TLR2诱导内皮衰老。TLR4是识别损伤相关分子模式（DAMPs）的关键受体，既往研究已证实HMGB1、血清淀粉样蛋白A等DAMPs可通过TLR4/2诱导衰老，本研究将组蛋白H3.1也纳入这一范畴。值得注意的是，H3.2并无相同效应，提示组蛋白亚型之间存在功能差异，其结构基础值得进一步探索。最后，本研究验证了衰老细胞清除药物D+Q可显著抑制NETs及H3.1诱导的SASP和中性粒细胞趋化，提示清除衰老内皮细胞或阻断NETs-H3.1-TLR4轴可能成为BD血管炎的新型干预策略。这一发现具有初步的临床转化潜力，但仍需在动物模型及前瞻性临床研究中进一步验证。综上，本研究通过多组学结合功能验证，系统揭示了CD177+PMN通过H3.1富集的NETs调控内皮衰老的新机制，为BD的免疫病理机制提供了新的理论依据，也为未来靶向衰老细胞或NETs的治疗策略提供了实验基础。参考文献：Wang X, Yu X, Wang X, Sun L, Zhang M, Wang Z, Liu Y, Ao Y, Wu J, Wang W, Liu J, Chen H, Zheng W. CD177+neutrophils promote endothelial senescence through extracellular traps in Behçet's Disease. Arthritis Rheumatol. 2026 May 11.
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