作者：周军，田艳娅，庞海燕，韩雪等，山东省潍坊市，山东第二医科大学附属医院生殖医学中心，山东第二医科大学临床医学院

精子冷冻保存是辅助生殖技术（assistedreproductive technology，ART）中的重要环节。自20世纪50年代该技术应用于临床以来，其应用范畴主要涵盖生育力保存与不育症治疗两大领域[1]。人类精子在冷冻保存过程中经历的冻融操作不可避免地会引起精子质量下降，而氧化应激是导致精子损伤的核心机制之一[2]。因此，在冷冻过程中添加抗氧化剂，可缓解氧化应激的负面影响，提升冷冻-复苏后精子的活力。目前，已有多种抗氧化剂应用于精子冷冻保存的研究中，例如线粒体靶向抗氧化剂、褪黑素及维生素E等[3]，均显示出一定的保护效应。然而，抗氧化剂的应用存在特异性不足、协同机制不明确等问题，亟需开发更具靶向性的抗氧化策略或多种抗氧化剂协同方案。白藜芦醇（resveratrol）是一种天然多酚类化合物，主要存在于葡萄皮、浆果和花生等植物中[4]。其具有抗氧化、抗炎、抗癌、

心血管保护、神经保护及抗糖尿病等多种药理作用，尤其在改善精子质量、保护卵巢功能以及调控氧化应激相关信号通路方面显示出应用潜力，有望应用于精子冷冻保存。现对精子冷冻保存中氧化应激的损伤机制、白藜芦醇的抗氧化特性及其在精子冷冻保存中的作用进行综述，以期为男性生育力保存和男性不育症治疗提供新的理论依据和研究方向。

1哺乳动物精子冷冻保存中的氧化应激损伤

1.1精子冷冻-复苏过程中的氧化应激活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量产生机制涉及多方面因素，主要包括线粒体功能障碍、NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）活性升高、精浆的去除以及金属离子催化作用等。首先，在冷冻-复苏过程中，温度急剧变化、渗透压波动及冰晶形成等物理与化学应激因素可损害精子线粒体结构与功能[5]，受损的线粒体在氧化磷酸化过程中产生超氧阴离子（·O2-）、过氧化氢（H2O2）等大量ROS，进一步加剧线粒体损伤，形成恶性循环[6]。其次，NOX作为精子中ROS的主要来源之一，其活性升高是产生过量ROS的重要机制之一[7]。目前在人类精子中仅发现NOX5亚型表达，虽然适量ROS为精子获能所必需，但在冷冻-复苏的应激状态下，NOX活性可能失控，导致ROS过量生成，超出精子自身抗氧化的防御能力[8]。此外，精浆中原本富含谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等多种天然抗氧化剂，然而在精液处理过程中为了浓缩精子或去除杂质，常需部分或全部移除精浆，致使精子周围抗氧化防御能力下降，从而更易遭受ROS攻击[9]。最后，若冷冻保护剂或培养基中含有微量过渡金属离子，或冷冻损伤过程中细胞释放金属离子，这些离子在H2O2存在条件下可催化芬顿反应（Fenton reaction），产生高反应活性的羟基自由基，加剧氧化损伤[10]。

精子冷冻-复苏过程还导致SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶活性降低或储备耗竭，破坏氧化还原稳态，引发氧化应激。研究表明，牛精子冷冻保存后过氧化物氧化还原酶5/6（peroxiredoxin 5/6，PRDX5/6）会发生转位和寡聚化，以应对冷冻诱导的氧化应激[11]。猪精子中沉默信息调节因子5（sirtuin 5，SIRT5）通过调控异柠檬酸脱氢酶2（isocitratedehydrogenase 2，IDH2）和SOD2信号通路参与代谢和氧化应激调控，SIRT5表达下降会加剧氧化损伤[12]。上述研究表明，冷冻应激不仅会诱发PRDX5/6等抗氧化酶的转位与寡聚化，同时SIRT5等关键调控因子表达下降也会加剧氧化损伤，共同阐明了冷冻过程中抗氧化防御系统失衡的分子基础。

1.2氧化应激对精子的特异性损伤过量ROS可攻击精子多个关键组分，导致特异性损伤，主要包括以下4个方面。首先，脂质过氧化损伤是其中重要机制之一。由于精子质膜富含多不饱和脂肪酸，极易发生脂质过氧化，从而破坏精子质膜的完整性与流动性，进而影响精子运动及其与卵母细胞的融合能力[13]。其次，DNA损伤也是常见的损伤后果。冷冻保存诱导的精子DNA损伤主要经由氧化应激而非细胞凋亡介导，其损伤程度与冷冻方法、保护剂类型及精子自身抗损伤能力密切相关。氧化应激可产生8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'deoxyguanosine，8-OHdG）等DNA氧化损伤产物，不仅能直接破坏DNA结构，还可能影响表观遗传调控，进而对胚胎发育和跨代健康产生远期影响[14]。再次，ROS可引起蛋白质氧化和功能失活。蛋白质羰基化是其主要氧化修饰形式之一，导致精子蛋白质结构与功能改变[15]。与精子运动相关酶的活性可能因此下降，而线粒体蛋白损伤则会影响ATP生成，进一步削弱精子的运动能力。最后，细胞凋亡与坏死等程序性死亡形式也与氧化应激密切相关。冷冻损伤不仅能引起物理和生化改变，还可诱导精子发生凋亡样变化[16]，其特征包括细胞收缩、染色质凝集和DNA片段化等。尽管凋亡是研究中关注较多的细胞死亡形式，但近期研究提示，铁死亡作为一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的细胞死亡，可能是山羊精子冷冻保存中的主要程序性死亡方式[17]。1.3氧化应激对胚胎发育的影响遭受氧化应激损伤的精子不仅自身功能受损，还可能对受精及早期胚胎发育产生一系列不利影响。首先，精子DNA损伤及功能异常会显著降低其与卵子的结合及受精能力，导致受精率下降，这已在哺乳动物研究中得到证实[18]。即使受精过程得以完成，胚胎的早期发育也可能因此受阻。其次，损伤精子所携带的DNA及表观遗传修饰异常可能进一步干扰胚胎的正常发育进程，从而引起胚胎发育阻滞或形态结构异常[19]。此外，更为重要的是，氧化应激还会影响精子中关键的表观遗传信息（包括DNA甲基化与组蛋白修饰），而这些修饰在胚胎早期发育阶段的表观遗传重编程中发挥重要作用。精子DNA的氧化损伤有可能通过受精过程传递至卵子内部，进而干扰后续胚胎发育的动态进程[20]。

2白藜芦醇的抗氧化特性

2.1白藜芦醇抗氧化作用的研究

白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，因具有显著的抗氧化和抗炎特性而备受关注，尤其在缓解氧化应激方面体现出多靶点、多通路的调控特征[21]。白藜芦醇的抗氧化机制不仅限于一定的直接清除自由基的能力，更主要的是通过调控促氧化与抗氧化酶基因的表达发挥转录调节剂的作用。白藜芦醇可通过上调SOD、GSH-Px和CAT等内源性抗氧化酶的活性显著增强细胞的整体抗氧化防御能力[22]。例如，在链脲佐菌素（streptozotocin）诱导的糖尿病大鼠模型中，白藜芦醇能够有效调节脑组织中的氧化应激生物标志物并提升抗氧化酶活性[23]。

白藜芦醇通过激活或调控多条信号通路发挥抗氧化作用，主要包括核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、SIRT1/叉头框蛋白O（forkhead box O，FoxO）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和AMP活化的蛋白质激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）等。①在Nrf2/ARE/HO-1通路中，Nrf2作为细胞氧化应激应答中的关键转录因子，可结合ARE启动下游HO-1和NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinonedehydrogenase 1，NQO1]等抗氧化酶表达[22]，而白藜芦醇是该通路的重要激活剂[24]。在生理条件下，Nrf2与Keap1结合并经由泛素化途径降解；而在氧化应激或白藜芦醇等激活剂存在时，Keap1发生构象改变或磷酸化，使Nrf2解离并转移至细胞核，与Maf蛋白形成异源二聚体后结合ARE，从而启动抗氧化基的转录[22]。研究结果表明，在脊髓损伤、TM4细胞及肠道损伤等多种模型中，白藜芦醇均通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化效应[25-27]。②白藜芦醇还可通过激活SIRT1/FoxO信号通路增强细胞抗氧化能力。SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的去乙酰化酶，参与调控细胞代谢、应激反应、炎症及衰老等多种生理病理过程[28]。白藜芦醇通过激活SIRT1，使其去乙酰化FoxO类转录因子（如FoxO3a），进而促进其核转位及抗氧化基因的表达[29]。值得注意的是，SIRT1的激活还可进一步促进Nrf2的活化，形成SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路的正向协同调控环路[30]。③白藜芦醇对PI3K/Akt信号通路的激活也在其抗氧化机制中占有重要地位。PI3K/Akt信号通路是调节细胞存活、增殖、代谢及抗氧化应激的核心通路之一[31]。白藜芦醇可激活该通路，进而促进Akt介导的Nrf2磷酸化及核转位，诱导HO-1等抗氧化基因的表达。④白藜芦醇还能够调节MAPK信号通路。MAPK信号通路在细胞应对增殖、分化、炎症及细胞死亡等多种外界刺激中发挥重要作用，氧化应激可激活该通路。⑤白藜芦醇对NF-κB信号通路具有抑制作用。NF-κB是炎症反应的核心调控因子，其激活可诱导促炎细胞因子和ROS的生成，形成炎症与氧化应激之间的正反馈循环。白藜芦醇通过抑制NF-κB活化，有效减轻炎症及相关氧化损伤[29]。值得指出的是，Nrf2与NF-κB信号通路之间存在交互作用，Nrf2的激活可负向调节NF-κB活性，有助于维持细胞内抗氧化-促炎平衡[27]。⑥白藜芦醇还可激活AMPK信号通路。AMPK作为细胞能量代谢的核心调控因子，在增强细胞抗氧化能力中发挥重要作用。作为AMPK的有效激活剂，白藜芦醇可通过调节NOX活性减少ROS的产生[32]。

总之，白藜芦醇通过多重分子机制与信号通路协同作用，显著增强细胞内源性抗氧化防御能力并减少ROS生成，从而有效缓解氧化应激所致的细胞和组织损伤。这也为其在神经退行性疾病、心血管疾病、肾脏疾病及炎症性疾病等多种病理过程中的应用提供了理论基础。

2.2白藜芦醇改善氧化应激的表观遗传调控表

观遗传调控是指在DNA序列不发生改变的情况下调节基因表达的机制，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控等方式。值得注意的是，氧化应激本身即可诱发表观遗传层面的改变，进而干扰基因表达与细胞功能[33]。白藜芦醇作为一种多效性天然化合物，其作用机制不仅限于经典的生化途径，还涵盖对表观遗传状态的再次编程调控。具体而言，在组蛋白修饰方面，白藜芦醇作为SIRT1的激活剂促进组蛋白的去乙酰化，从而改变染色质结构并调控基因转录[34]。在DNA甲基化方面，传统认知中，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）是这一修饰的关键催化酶；而近年研究发现，甲基胞嘧啶双加氧酶（ten-eleven translocationmethylcytosine dioxygenase,TET）介导的主动去甲基化过程对于维持甲基化动态平衡至关重要。氧化应激可同时干扰DNMT与TET酶的活性，导致甲基化模式的异常。白藜芦醇通过调节DNMT的表达和活性调控甲基化的动态平衡[35]。例如，在非酒精性脂肪性肝病模型中，白藜芦醇通过调控Nrf2-Keap1基因启动子区域的甲基化水平延缓疾病进展[36]。此外，微RNA（microRNA，miRNA）也在基因表达的表观遗传调控中发挥关键作用，氧化应激可影响miRNA的加工过程与功能活性[37]。尽管直接证据尚不充分，但白藜芦醇对基因表达的整体调控可能包括对非编码RNA的间接影响。值得注意的是，白藜芦醇的这些表观遗传调控机制在生殖系统衰老中可能也发挥作用。有研究提示，白藜芦醇对卵巢衰老过程中表观遗传重编程的调节作用可能与特定基因的甲基化状态改变有关[38]。

3白藜芦醇在精子冷冻-复苏中的应用和研究

多项实验研究表明，在冷冻保存液中添加适量白藜芦醇可显著提高解冻后精子的活力、膜完整性及线粒体功能。白藜芦醇的保护作用已在多种动物模型中得到验证。在公猪精液中，白藜芦醇可提高精子运动参数、膜完整性、顶体完整性和线粒体膜电位[39]。在对公羊精子的研究中发现，添加白藜芦醇（特别是50μmol/L）显著提高了精子的SOD和CAT活性，同时降低了脂质过氧化产物丙二醛的水平，并改善了解冻后的精子活力、顶体完整性和膜完整性[40]。

实验研究为白藜芦醇的应用提供了有力证据，但其临床转化仍面临诸多挑战。首先，剂量与毒性问题亟待解决。不同研究中白藜芦醇的使用浓度差异较大，其最佳有效剂量依物种和精液处理方法而异。例如，在人类精子研究中已尝试使用0.1、1.0、10.0 mmol/L等不同浓度的白藜芦醇，其中低浓度可提高精子活力且未显示毒性，而高浓度则表现出细胞毒性，尤其是对精母细胞的毒性更为显著[41]。因此，亟需通过系统研究确定对人体既安全又有效的适宜剂量范围。其次，白藜芦醇的作用机制尚需深入阐释。尽管已知白藜芦醇参与调控多条信号通路，但其精细的分子网络尤其是与线粒体功能、DNA修复、顶体反应和获能等受精关键环节之间的具体联系仍有待进一步解析。例如，精子线粒体蛋白的表达水平与精子活力及抗冻能力密切相关[42]，白藜芦醇对这些蛋白的表达和功能的影响尚需深入研究。目前关于白藜芦醇用于人类精子冷冻保存的研究相对有限，且多局限于体外实验或动物模型。为推动其临床应用，必须依托设计严谨、大规模、随机对照的临床试验，全面评估其长期稳定性、安全性、有效性，以及对受精率、胚胎发育质量和活产率等ART结局指标的实际影响。再次，白藜芦醇的制剂与递送系统也是关键制约因素。白藜芦醇水溶性差、生物利用度低，严重限制了其临床应用。开发如纳米结构脂质载体（nanostructuredlipid carriers，NLC）这样的高效递送系统以提高白藜芦醇在冷冻保护液中的溶解度、稳定性和对精子细胞的递送效率，是未来的重要研究方向。已有研究表明，负载白藜芦醇的NLC在改善冷冻公鸡精子质量方面的效果优于游离药物[43]。最后，白藜芦醇与现有冷冻保护剂的兼容性也不容忽视。需全面评估白藜芦醇与常规冷冻保护剂之间的相容性，以及其对冷冻保护剂效能与安全性的潜在影响。同时，探索白藜芦醇与肌醇、胸腺醌、维生素C、半胱氨酸等其他抗氧化剂或L-脯氨酸、甲基硫代乙醇、L-谷氨酰胺等冷冻保护添加剂的联合应用，可能通过协同效应进一步提升精子冷冻保存的效果[44]。

4结语与展望

白藜芦醇不仅能直接清除ROS，还能通过激活Nrf2/ARE、SIRT1/FoxO及PI3K/Akt等关键信号通路上调内源性抗氧化防御，并可能涉及组蛋白修饰与DNA甲基化等表观遗传调控，从而多维度保护精子。大量临床前研究证实，添加适宜浓度白藜芦醇可显著改善冻融后精子的活力、膜完整性及DNA完整性。然而，其临床转化仍面临挑战：最佳剂量窗口暂未明确且高浓度具有细胞毒性；对线粒体功能、DNA修复等深层机制的认识仍需深化；其水溶性差、生物利用度低的问题亟待通过纳载体等新技术解决。最终，必须通过严谨的大规模临床试验评估其对ART结局指标的实际效益。未来系统的研究有望使白藜芦醇成为一种高效、安全的创新型精子冷冻保护添加剂，为男性生育力保存提供新策略。

参考文献略。

来源：周军,田艳娅,庞海燕,等.白藜芦醇在精子冷冻保存中的应用及其研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2026,45(02):133-138.