作者：刘淼，谢月娜，天津市血液中心检验科

纵观历史,疾病往往是在战争、贸易和人口流动不断发展的条件下发生的。在全球化时代的今天,货物和人员的流动性极高,人们在寻求经济快速发展的同时忽略了环境的保护,野生动物栖息地日益城市化、全球变暖、永久冻土以及海冰的融化,这些都将造成人类的生存环境进一步恶化。在过去的40年里,新发和再发病原体越来越多地出现:

东南亚爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-Co V)、非洲的埃博拉病毒(Ebolavirus)、中东的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V),以及美洲的寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、黄热病毒(yellowfevervirus)和登革病毒(Denguevirus,DENV)[1-2];最后,在2020年,世界卫生组织宣布由新型冠状病毒(SARSCo V2-)引起的新冠肺炎疫情为世界大流行,导致全球680多万人死亡[3]。2002年首次报道了通过输血传播西尼罗河病毒的病例,强调了新发和再发的病原体同样对输血安全构成了严重的威胁[4]。鉴于新发与再发传染病具有显著的不可预测性与流行病学特征不明确性,其经输血传播的潜在风险不可预估。而当前常规血清学检测体系受限于病原体数据库更新滞后性,导致多数新兴病原体未被纳入标准筛查谱系,存在血清学窗口期盲区。在此背景下,实施病原体减少技术(pathogenreductiontechnologies,PRT)成为风险控制的优先选择。PRT是指一系列旨在降低或消除病原体数量的方法或过程。这些技术通常应用于血液制品、生物制品、医疗器械以及医疗环境中,以减少病原体传播给接受者或被感染者的风险。文章综述了当前全球流行的新发病原体的感染情况以及经输血传播现状,探讨PRT如何有助于提高输血安全,应对未来病毒威胁的挑战。

1 经输血传播的新发和再发病原体

1.1 戊型肝炎病毒

戊型肝炎病毒(HEV)是一种可以引起急性肝炎的嗜肝病毒,在大多数成人中通常是自限性的,但在免疫功能低下的个体中可发展为慢性感染。这种病毒于1983年在从阿富汗返回的苏联士兵中爆发不明原因的肝炎期间首次被发现[5]。最新研究表明,HEV主要有8个基因型。HEV-1和HEV-2只感染人类,在亚洲、非洲、中东和墨西哥等非发达国家地区高度流行,一般通过污染的水源进行传播。相比之下,HEV-3和HEV-4属于人畜共患病毒,主要的动物宿主是家猪,这两种基因型引起的多数为急性、自限性肝炎,因此很少发生大范围的传播。HEV-7主要在骆驼中发现,但也有免疫受损的受血者经输血传染HEV的报道[6]。因为在健康的献血者中,HEV的感染通常无明显症状,并且大多数国家对无偿献血者的常规筛查项目并不包括HEV,所以随着HEV在全球流行率的上升以及感染后可能造成的严重临床后果,经输血传播HEV(transfusion-transmitted HEV,TT-HEV)已成为一个严重的公共健康问题[7]。

1.2 猴痘病毒

猴痘是一种人畜共患疾病,这种疾病是由猴痘病毒(Mpoxvirus,MPXV)引起的。人与人之间的传播被认为是通过接触患者体液、被污染的物品以及呼吸道飞沫进行的,也存在母婴垂直传播,尚不能排除性接触传播[8]。猴痘是一种相对较少引起关注的疾病,人类病例大多局限于非洲大陆。但自2022年5月以来,猴痘在多个国家发生了意外爆发,病例数迅速增加,且难以控制[9]。虽然MPXV的传播途径主要是皮肤接触,通过输血传播的机制目前尚不清楚,但是有研究显示,MPXV会在感染患者体内迅速播散并引起病毒血症,这就造成了潜在的血源性传播的可能性,使输血传播在理论上成为可能[10-11]。

1.3 DENV

登革热(denguefever,DF)是一种由DENV引起的急性传染病,是全球传播最广泛的蚊媒传染病之一,在我国主要经媒介伊蚊(俗称“花斑蚊”)叮咬传播,人与人之间一般不会直接传播[12-13]。最近研究显示,DENV已经感染全球128个国家,每年新发DF病例约有5840万例,导致约1万人死亡,近40亿人面临感染的风险[14]。DENV感染后的临床症状可表现为无症状感染,也可引起DF、登革出血热及登革休克综合征等严重并发症。虽然DENV感染的主要传播途径是通过蚊媒传播,但输血和器官移植也可造成病毒的传播[15-16]。2008年中国香港报道了第1例可能的TT-DENV病例,随后新加坡又发现3例感染DENV的受血者[17]。根据流行病学研究,DENV被感染者可能无临床症状而呈现亚临床感染状态,这类病毒携带者仍可能处于病毒血症期,进而成为献血者群体的潜在风险来源。与多数血源性传播病原体相似,单纯依赖体温监测指标排除疑似病毒暴露的献血个体,无法实现输血传播风险的完全防控。巴西、印度和新加坡的17项研究表明,在DF疫情期间,无症状献血者的DF血症发生率为0.5%[18-19]。所有接受无症状献血者血液的患者在几天后都会出现DF相关症状[20]。因此,在DF流行地区进行献血者DENV的筛查对保证血液安全至关重要。

1.4 ZIKV

ZIKV最早于1947年在乌干达寨卡森林的一只恒河猴中发现,随后在1948年从非洲伊蚊中分离出来[21],可通过蚊虫或蜱叮咬传播。急性ZIKV感染通常无症状,表现为自限性疾病,常在一周内消退[22]。鉴于ZIKV多为无症状感染,但对胎儿有严重的临床后果,因此该病毒对血液安全构成威胁。2016年6月20日,美国红十字会按照美国食品药品监督管理局(FDA)批准的试验性新药协议,启动了针对ZIKV RNA的筛查,使用的是Grifols公司的ZIKV检测试剂盒[23]。中国并不是ZIKV的流行区域,报道的病例主要是输入病例。Zhou等[24]对中国南宁273份健康人群血液标本的ZIKV抗体调查研究显示,Ig G和Ig M抗体的阳性率分布为9.5%(26/273)和1.8%(5/273)。

1.5 CHIKV

基孔肯雅病是由CHIKV引起的一种急性传染病。人类是病毒的主要宿主,感染者(包括显性和隐性感染者)通过伊蚊叮咬成为新的传染源。隐性感染者在流行病学中尤为重要。该病的特征是急性发热和严重的关节疼痛[25];大多数CHIKV感染是有症状的,但大约15%的感染是无症状的。研究表明,CHIKV RNA不仅在有临床症状的患者中检测到,而且在潜伏期和无症状的感染者中也检测到[26]。在2014年波多黎各的大规模爆发期间,发现有部分献血者在潜伏期或无症状感染时,血液中CHIKV的载量低于3.2~2.3×107拷贝/m L。56份阳性CHIKV RNA样本中,有8个(14.3%)被认为有高度传播CHIKV的风险,其病毒载量较高(104~109RNA拷贝/m L),并且缺乏特异性Ig M和Ig G抗体[27]。这就对输血安全构成威胁。

1.6 SARS-Co 

V2-SARS-Co V2-是一种引起2019年末开始的全球大流行的病毒,它的出现威胁了全球人类的生命健康。虽然该病毒主要传播途径是呼吸道传播,但在大流行早期,血液传播已被理论化[28]。全球血液中心和医疗机构采取了严格的预防措施来确保血液供应的安全。但不幸的是,这导致了对血液供应的毁灭性影响,造成了严重的血液短缺。世界卫生组织估计,其所有6个地区的血液供应将减少20%~30%[29]。此外,美国红十字会报告称自大流行开始以来,捐款数量下降了10%。另有研究显示,新冠肺炎疫情期间献血量平均下降38%,在一些地区达到67%[30]。即使解除封锁限制后,血液服务机构的全血献血者可用性仍然较低。血液中心现在必须集中精力恢复推迟献血者的个人意愿。此次新冠肺炎疫情的大范围传播强调了新出现的病毒对输血医学的短期和长期影响。因此PRT在疾病暴发早期减轻这些影响方面很有价值,尤其是当新病原体的病理生理学和传播方式仍然未知时。

1.7 埃博拉病毒

埃博拉病毒是一种具有高度传染性的人畜共患病毒,可导致急性出血热和死亡。人与人之间传播的主要方式是通过直接接触受感染患者的体液和组织,其潜伏期可长达21d[31]。较长的潜伏期提高了遏制病毒传播的难度,研究显示该病毒暴发期间死亡率可达25%~90%[32]。由于高死亡率以及传播途径的复杂性,美国疾病控制中心将埃博拉病毒列为四级病毒,是生物安全等级系统中传染性最强、防护要求最严格的病毒之一。目前有研究显示,埃博拉患者在临床症状缓解数月后在多种体液中检测到传染性病毒和RNA[33]。此外,有报道称,该病毒的最低感染剂量约为10个病毒颗粒,这个数量非常低,因此必须采取预防措施以避免可能的输血传播[34]。

2 PRT在应对新发再发病原体威胁中的应用

在过去40年间,为了应对病原体对血液安全构成的威胁,减少经输血传播传染病的风险,检测手段已经从最开始的血清免疫学测定,发展为乙型肝炎病毒(HBV DNA)、丙型肝炎病毒(HCVRNA)以及人类免疫缺陷病毒(HIV RNA)的核酸检测,大幅度地缩短了病毒感染后检测的窗口期。然后,核酸检测筛查也具有一定的局限性,例如献血者处于具有潜在传染性的窗口期阶段,病毒载量低于试剂检测下限时,无法检测到病毒的存在。另外,由于气候环境的变化、社会发展的迅速使得新发、再发病原体的发生变得不可预测,现有的检测手段不能及时地应对此变化,这就对输血安全构成了严重的威胁,凸显了反应性预防策略在及时快速解决紧急需求方面的不足。病原体减少(PR)是降低输血传播感染风险的主动策略。可用的PR方法主要包括破坏病原体结构的物理化学方法以及通过光化学的方法修饰病毒核酸以防止其复制[35]。下文就几种PRT进行综述。

2.1 亚甲蓝光化学法

亚甲蓝又名美蓝(methyleneblue,MB),这种在实验室中常见的染料,除了赋予样本鲜艳的色彩外,还被发现具有消毒剂的特性,能够有效地灭活某些病毒。亚甲蓝与可见光协同作用可激活产生单线态氧,单线态氧可与病毒核酸的鸟嘌呤结合形成8-羟鸟嘌呤,引起碱基位点丢失或核酸链的断裂,从而阻止病毒DNA复制[36]。例如,使用1μmmol浓度的亚甲基蓝和1h的可见光照射,可成功灭活了300 m L新鲜人血浆中的HIV-1、HIV-2、HBV、HPV、辛德毕斯和西尼罗病毒等包膜病毒[37]。最新的研究还显示了亚甲蓝光化学法使急性呼吸窘迫综合征冠状病毒失活以及使人血浆中的SARS-Co V2-病毒失活的可能性[38]。Arentz等[39]用0.000 1%MB(3.1μM)结合20000lx宽带LED光束将细胞内SARS-Co V2-病毒的病毒载量降低了99.99%。但是,鉴于其具有一定的疏水性,该化合物无法穿透质膜灭活细胞内病毒,且不能破坏白细胞,因而不能降低输血相关移植物抗宿主病(TA-GVHD)的发生率,也无法应用于红细胞成分的灭活。尽管MB不会使细胞内病毒灭活,但是血浆的冷冻和解冻通常会破坏白细胞的细胞膜,从而释放病毒颗粒,并使它们易受MB的影响。因此,该技术对降低输血传播感染风险,增强血液安全具有重要意义。使用亚甲蓝进行病毒灭活,需要精确控制其浓度和与病毒接触的时间,以确保达到最佳的灭活效果,同时尽量减少对样本其他成分的影响。临床研究数据显示,经亚甲蓝光化学病毒灭活技术(MB-P)处理的血浆制品在维持治疗有效性方面与传统新鲜冰冻血浆具有等效性,同时实现严重不良事件发生率控制在0.05‰水平,展现出良好的临床安全谱,现已成为输血医学领域的主流选择[40]。然而值得注意的是,该灭活工艺通过光敏反应产生的活性氧成分可能导致血浆蛋白质构象改变,具体表现为关键凝血因子(特别是热敏感性因子Ⅴ、Ⅷ及高分子量纤维蛋白原)的生物学活性下降幅度达30%左右。这种蛋白功能衰减现象使得MB-P处理后的血浆无法满足冷沉淀制剂的生产标准,相关质量缺陷已在多项体外试验中得以验证[41]。此外,亚甲蓝的使用还应考虑到可能的细胞毒性或其他潜在的不良反应,特别是在涉及活细胞或活体实验时,必须在专业人员的指导下谨慎使用。

2.2 补骨脂素S-59光化学法

补骨脂素S-59(amotosalen hydrochloride,S-59)光化学法是一种利用补骨脂素作为光敏剂,在特定波长的光照射下引发化学反应的方法。补骨脂素灭活病毒的原理主要基于其独特的分子结构和光敏特性。补骨脂素具有高度水溶性,能够可逆地插入病毒的DNA和RNA螺旋体中,当受到特定波长的光(如UVA)照射时,其光化学活性位点与核酸链中的嘧啶碱基发生[2+2]环加成反应,形成稳定的单链内环丁烷加合物及双链间交联结构。试验数据显示,当交联密度达到1个交联点/100bp时,即可有效阻滞DNA解旋酶作用,致使病毒基因组丧失转录活性。这种不可逆的核酸修饰作用最终导致病毒粒子失去复制能力和宿主细胞感染性。此外,补骨脂素及其衍生物还具有其他抗病毒机制。例如,它们可以下调病毒转录因子的表达,抑制病毒RNA的转录和核心蛋白的表达,从而进一步抑制病毒的复制[42]。相较于MB,S-59可穿过细胞膜,拥有破坏多种病原体和细胞内病毒核酸的优势,可用于血浆和血小板病毒的灭活,但不能应用于红细胞,因为血红蛋白会吸收UVA,影响S-59的活性。此外,该方法处理的血浆中凝血因子的活性可保持在73%~98%,满足冷沉淀的制备要求[43]。这种多机制的病毒灭活作用使得补骨脂素及其衍生物在病毒灭活中具有广阔的应用前景。Cerus公司将S-59与UVA结合,开发了INTERCEPT系统,该系统在对病原体进行灭活的同时能够灭活供体残留的白细胞,包括T细胞,可以预防TA-GVHD[44]。该技术经过临床试验和队列研究证明其严重不良事件发生率差异无统计学意义,包括血栓栓塞和过敏反应[风险比1.09(0.88~1.35)]、急性输血反应[风险比0.96(0.75~1.24)]以及其他不良事件[风险比1.01(0.97~1.05)][45]。在2021年12月,加拿大卫生部批准了Cerus INTERCEPTTM病原体灭活技术用于在加拿大血液中心生产经补骨脂素处理的混合血小板,研究证明包括HIV-1/2、巨细胞病毒、DENV、SARS-Co V2-病毒等大多数病原体减少3log以上[46]。但是用INTERCEPT系统进行处理有约20%的S-59及部分光副产物残留,这有可能成为潜在过敏原。

2.3 核黄素光化学法

核黄素,也称为乳黄素或维生素B2,是一种来自B族复合物的维生素,对人类来说是必需的营养素。在没有氧气的情况下,核黄素被紫外线或可见光激活,通过直接电子转移反应氧化DNA和RNA中的鸟嘌呤残基;而在有氧情况下,则会产生超氧阴离子O2-和HO2,导致鸟嘌呤的光氧化,从而破坏核酸灭活病原体[47]。TerumoBCT公司将核黄素与紫外线(280~400nm)相结合开发了灭活血浆和血小板中病原体的Mirasol PRT系统。该系统已被证明可以灭活一系列细菌、病毒以及寄生虫,包括虫媒病毒、CHIKV[48]、DENV[49]以及西尼罗病毒[50]等。相对于INTERCEPT系统而言,血浆和血小板经过Mirasol PRT系统处理后,不需要对残留物和代谢产物进行额外的去除步骤。凝血因子Ⅱ、Ⅷ和Ⅴ的活性保留率分别为80%、75%和73%。抗凝血酶、蛋白S、α2-抗纤溶酶和纤溶酶原活性保持率在91%~100%[51]。因为核黄素+紫外线可加速红细胞存储损伤并促进红细胞凋亡,因此Mirasol PRT系统不宜用于红细胞病原体灭活[52]。此外,使用Mirasol PRT系统进行的体外研究表明,T细胞增殖会被完全抑制。在限制性稀释分析研究中,经过Mirasol处理的T细胞活性降低到检测限的60%(3.7J/m L),与Intercept系统一样,使用Mirasol系统可以预防TA-GVHD。体内研究表明,Mirasol系统可以防止在抗CD3/CD28或LPS刺激下产生细胞因子(TNF-a、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-c),并且在储存至8d的Mirasol处理的血小板中未检测到任何由白细胞衍生的细胞因子[53]。这些数据表明,Mirasol系统灭活后的血液成分可能预防非溶血性输血反应。

2.4 THERAFLEX UV-Platelets系统

THERAFLEX UV-Platelets技术是一种用于血液制品病毒灭活的先进技术,与光化学法相比,该技术无需添加光敏剂,从而避免了光敏剂可能带来的潜在风险。该技术仅依靠短波(254nm)紫外线C(UVC)与核酸的直接相互作用来灭活病原体[54]。然而,由于UVC所具有的短波长光特性,它在相对透明的介质中最为有效。因此,在相对浑浊或含有蛋白质的溶液中,其反应性会减弱,因此它只能用于灭活单采血小板和富血小板血浆中的血小板产品。通过精确控制紫外线照射的剂量和时间,THERAFLEX UV-Platelets技术能够最大限度地保留血小板的功能和质量,确保血液制品的有效性[55]。由于没有向血液产品中添加光敏化合物,因此在使用Theraflex系统处理后不需要过滤。

2.5 有机溶剂/去污剂混合物灭活技术

有机溶剂/去污剂混合物(SD)灭活技术主要利用有机溶剂(如磷酸三丁酯)和去污剂(如聚乙二醇辛基苯基醚、Triton-X系列)的协同作用,破坏病毒的脂质包膜。这种技术对非包膜病毒如甲型肝炎病毒、HEV和细小病毒B19无效,并且已被证明不会破坏血浆对革兰氏阴性细菌的补体活性[56]。SD法是目前对汇集血浆进行病毒灭活的唯一技术,也是使用最广泛的病原体灭活技术。在欧洲和美国经过SD技术灭活后的血浆可作为混合产品进行销售,他们认为这种血浆产品减少了朊病毒,且没有输血相关急性肺损伤的风险[57]。根据制造商的说法,从多个供体混合后的血浆可以显著稀释任何抗粒细胞和抗人淋巴细胞抗原抗体,这可以降低输血反应的风险[58]。SD灭活技术中使用的有机溶剂和去污剂可能在灭活过程中产生残留,对血液制品和生物制品的安全性构成潜在威胁。因此,需严格控制化学试剂的用量和灭活条件,确保残留量在安全范围内。

2.6 尚未进入临床应用的PRT

2.6.1 S-303灭活技术 S-303病毒灭活技术是一种针对血细胞制品,尤其是红细胞的病毒灭活技术。Amustaline(S-303)是一种靶向核酸的烷基化剂,其灭活病原体的原理是通过靶向并嵌入病原体的核酸中,利用双烷基基团与亲核试剂反应,从而破坏病原体的核酸结构,使其失去复制和感染能力。该技术对红细胞的损伤较小,处理后的红细胞能够保持较好的功能和存活率。与某些需要光照的病毒灭活技术相比,S-303技术不依赖光照,可在室温下进行,仪器设备仅需要一台生物安全柜,操作简便,更适用于偏远地区或资源有限的国家。S-303病毒灭活技术已经经过了多年的研究和临床试验。虽然S-303在临床Ⅲ期试验中遇到了抗体形成的问题,但第二代S-303系统通过加入谷胱甘肽并增加其用量,已经解决了这一问题,且有研究证明经过二代S-303灭活后的红细胞储存35d后其生理功能满足临床输血要求[59]。目前,该技术的临床前病原体灭活研究、血清学评估、红细胞存活率评估等已经完成,并已启动Ⅲ期临床疗效研究。已有研究证明了S-303/GSH系统对CHIKV、DENV以及ZIKV具有灭活作用,其中CHIKV的灭活水平>(10.49±0.15)log10GEq/m L,满足

FDA建议PRT需实现6~10log10GEq/m L的病原

体载量减少的要求[60]。

2.6.2 PEN110灭活技术 PEN110是一种由特定乙烯亚胺寡聚物构成的化合物。这些寡聚物通过静电作用与DNA和RNA碱基结合,随后与其形成共价键,从而有效阻止病原体基因组的翻译或复制过程。PEN110技术,又称INACTINE技术,是近十余年来开发的一种用于红细胞病原体灭活的高效方法。该技术能够有效灭活多种病毒,包括具有脂包膜和无脂包膜的病毒,以及以RNA或DNA为遗传物质的病毒,展现出显著的广谱性。此外,PEN110对细菌也具备一定的灭活能力,能有效灭活巴贝虫等原虫。因此,PEN110病毒灭活技术在提高血液制品安全性方面展现出广阔的应用前景。已有研究证明,PEN110技术可以显著降低HCV和细小病毒B19的滴度,对恶性疟原虫以及产气荚膜梭菌也具有一定的灭活作用[61]。此外,经过PEN110处理的红细胞在42d的储存期内裂解率都低于1%,红细胞内钾离子的水平与对照组比较差异无统计学意义,说明PEN110对细胞膜的通透性无影响[62]。该项技术在经过Ⅰ、Ⅱ期临床试验后,于Ⅲ期临床研究中发现受试者体内产

生了针对PEN110RBC的抗体,目前该难题尚未攻克。

2.6.3 低温等离子技术 近几年低温等离子技术在病原体灭活中的应用价值备受关注。首先该技术操作温度范围通常在30~60℃,这意味着它能够在不损伤生物组织或不耐热基质的情况下,有效杀灭细菌、病毒和真菌等病原微生物。其次该技术产生的活性氧和活性氮等活性物质,能够与微生物的细胞膜发生反应,破坏其细胞壁和细胞膜,导致细胞内大分子物质泄漏,从而实现灭活。此外,这些活性物质还能损伤微生物的DNA和蛋白质,从而进一步确保灭活效果。多项试验已证实,低温等离子体具有显著的病毒灭活能力,例如对猫杯状病毒、腺病毒以及单纯疱疹病毒1型均表现出良好的抑制效果[63]。有研究人员对A型流感病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒3型的悬浮液进行了高能深紫外线照射,并结合冷氧等离子体处理,试验结果显示,经过冷氧等离子体处理后,这三种病毒的数量均显著减少[64]。目前,关于低温等离子体技术对血液中各种细胞成分的影响尚缺乏相关试验证明,因此需要进一步的研究来确保其安全性和有效性。

3 结论

未来全球化贸易的不断发展,环境气候的不断变化将继续推动人类群体中新发病原体的出现,其中一些病原体已被证实可以经输血传播疾病,而血站现有的常规筛查手段在面对新发再发传染病方面的有效性较低。此外,为了某些传播途径未明和传染性未知的病原体而进行额外筛查和推迟献血者捐献的策略在未来不太可能持续,并且在某些情况下,由于区域感染的阳性检出率较低,这种方法成本也较高。因此通过主动减少病原体的方法来消除血液制品的传染性至关重要。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略。

来源：刘淼,谢月娜.病原体减少技术在降低新发再发病原体对输血安全影响中的应用[J].临床血液学杂志,2026,39(02):170-176.

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