目的　探讨富氢水对L⁃精氨酸诱导的小鼠急性坏死性胰腺炎（ANP）的治疗效果及其作用机制。 方法　将小鼠按数字表法随机分成模型组（10例）、富氢水组（10例）和对照组（5例）。小鼠腹腔注射10% L⁃精氨酸（2.5 g/kg，每小时1次，共3次）建立ANP模型，模型组注射L⁃精氨酸同时腹腔注射生理盐水每次0.5 ml/只，共3次，富氢水组注射L⁃精氨酸同时腹腔注射富氢水每次0.5 ml/只，对照组只注射等量生理盐水，随后富氢水组予富氢水0.5 ml/次灌胃，每日3次，持续72 h，模型组和对照组予等量饮用水灌胃。观察记录各组小鼠的精神状态、72 h内生存率。取胰腺及腹腔注射部位皮肤组织行苏木精⁃伊红（HE）染色评估病理损伤，免疫组织化学染色法检测胰腺组织氧化应激相关标志物（HO1、SOD1、iNOS2、NOX2）及炎症因子相关标志物（TGF⁃β、TNF⁃α）表达。 结果　模型组小鼠精神萎靡，体重显著下降，富氢水组小鼠精神状态良好，体重下降幅度较模型组明显减轻；模型组、富氢水组和对照组的死亡率分别为60%（6/10）、10%（1/10）和0（0/5）；腹腔注射部位皮肤溃烂发生率分别为50%（5/10）、10%（1/10）和0（0/5）；HE病理显示在模型组中炎性细胞浸润、组织充血水肿和坏死的发生率分别为100.0%（6/6）、100.0%（6/6）和66.7%（4/6），富氢水组上述病变的发生率分别为77.8%（7/9）、33.3%（3/9）和0（0/9），对照组则分别为40.0%（2/5）、0（0/5）和0（0/5）。免疫组织化学染色结果显示，与对照组比较，模型组HO1和SOD1的表达显著降低，富氢水组HO1、SOD1表达较模型组显著上调（P值均<0.05）；模型组iNOS2及TGF⁃β表达较对照组均显著升高，以上差异均有统计学意义（P值均<0.05）。富氢水组较模型组iNOS2、NOX2、TGF⁃β、TNF⁃α表达水平均有所降低，但差异无统计学意义。 结论　富氢水可能通过上调内源性抗氧化酶HO1、SOD1表达、抑制iNOS2/NOX2介导的氧化爆发，并抑制炎症因子TGFβ、TNFα的表达，从而减轻ANP小鼠胰腺组织病理损伤及全身炎症反应。

急性胰腺炎（AP）是一种以胰酶异常激活、氧化应激爆发和炎症级联放大为核心特征的危重疾病，治疗策略正从单一药物向“抗氧化⁃抗炎”联合干预转变。近年来，随着对AP病理生理机制的深入理解，新型治疗策略不断涌现，其中富氢水作为一种新型治疗手段，因其独特的选择性中和•OH/ONOO⁻、抑制NOX2/iNOS介导的氧化爆发、阻断NF⁃κB/p38⁃MAPK信号通路等生物学特性而受到广泛关注。富氢水，即富含氢分子的水，已被证实对多种炎症疾病具有潜在的治疗作用。相较传统抗氧化剂，富氢水具有高弥散性、无细胞毒性、制备简便且可经口服或腹腔注射途径给药的优势，特别适合AP这类需快速控制全身炎症和氧化损伤的病理场景。在AP的临床前研究中，富氢水显示出了显著的治疗效果，能够减轻氧化应激和炎症反应，降低血清内毒素、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha antibody, TNF⁃α）、白介素6（interleukin⁃6, IL⁃6）等炎症因子的水平，并改善胰腺组织的病理损伤。此外，富氢水对大鼠AP时肠黏膜屏障的保护作用也得到了研究证实，其可能通过改善肠黏膜屏障功能，从而降低血浆D⁃乳酸和二胺氧化酶含量。在分子机制方面，富氢水的抗炎作用与其对p38⁃MAPK、NF⁃κB等炎症相关信号转导通路的调控密切相关。富氢水能够通过抑制这些信号通路的激活，减少炎症因子的产生，从而发挥抗炎作用。值得注意的是，既往关于富氢水干预AP的研究多聚焦于雨蛙肽或胆盐制备的动物模型，对其在L‑精氨酸诱导的急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis, ANP）中的治疗潜能及分子机制缺乏系统评价。本研究采用高致死性L⁃精氨酸模型，探讨富氢水能否有效治疗ANP小鼠，为其临床转化提供确切的实验依据。

 材料和方法 

一、药品及试剂

富氢水由上海镜观生物科技有限公司提供的氢水机器生产（产品型号：GZ⁃Y801，执行标准：GB/T1.1⁃2009）；L⁃精氨酸购于上海阿拉丁生化科技有限公司（CAS号：74⁃79⁃3）；SP免疫组织化学染色试剂盒购自福州迈新生物科技有限公司；兔抗血红素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO1）多克隆抗体、兔抗诱导型一氧化氮合酶2（inducible nitric oxide synthase 2，iNOS2）多克隆抗体、兔抗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2, NOX2）多克隆抗体和兔抗超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）多克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGF⁃β）多克隆抗体和TNF⁃α多克隆抗体购自上海艾博抗贸易有限公司。

二、实验动物与分组

25只SPF级6周龄雄性C57BL/6J小鼠购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司［许可证号：SCXK（豫）2020⁃0005］，体重20.0~24.0 g，环境温度20~25℃，湿度60%~70%，自由饮食，适应性饲养1周后，按照数字表法将小鼠随机分为模型组（10只）、富氢水组（10只）和对照组（5只）。小鼠腹腔注射10% L‑精氨酸（2.5 g/kg，1次/h，共3次）建立ANP模型，模型组注射L⁃精氨酸同时腹腔注射生理盐水（每次0.5 ml，共3次），富氢水组注射L⁃精氨酸同时腹腔注射富氢水（每次0.5 ml），对照组只注射等量生理盐水；随后富氢水组予富氢水0.5 ml/次灌胃，每日3次，持续72 h，模型组和对照组予等量饮用水灌胃。实验结束后，对小鼠进行麻醉，将腹部毛发剃光，完整剪取皮肤组织，然后解剖小鼠，充分暴露腹腔，取胰腺组织并置于10%甲醛溶液中固定，后续进行组织病理学检查。

三、观察指标

1. 小鼠一般状态及生存率：观察并记录小鼠的精神状态、72 h内生存率及腹腔注射部位皮肤溃烂情况。

2. 胰腺及皮肤组织病理学检查：胰腺及皮肤组织标本常规石蜡包埋、连续切片、苏木精⁃伊红染色，光学显微镜下观察各组胰腺及皮肤组织病理学变化，并统计胰腺组织炎性细胞浸润、组织充血水肿和坏死等发生率。

3. 氧化应激相关因子及炎症相关因子在小鼠胰腺组织表达的检测：采用免疫组织化学染色法检测各组小鼠胰腺组织氧化应激相关标志物HO1、SOD1、iNOS2、NOX2及炎症因子相关标志物TGF⁃β、TNF⁃α的表达。HO1、SOD1、iNOS2、NOX2、TGF⁃β和TNF⁃α一抗工作浓度均为1∶200，二抗工作浓度为1∶500。光学显微镜下观察，阳性表现为细胞质呈淡黄色至呈深褐色。结果判定采用二级计分法，根据阳性细胞占比将阳性细胞数量分为0~100；根据染色强度分类：淡黄色为1分，黄或深黄色为2分，褐或棕褐色为3分。两者计分相乘得出最终结果，总分为0~300分。

四、统计学处理

采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用x̄ ± s 表示，两样本间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

 结　果 

一、富氢水对ANP小鼠生活质量及生存率的影响

模型组与对照组比较，小鼠出现精神萎靡和显著的体重下降［（19.3±1.8）g比（21.8±1.2）g, t=2.68, P<0.05］，富氢水组小鼠精神状态良好，体重下降幅度显著小于模型组［（21.0±0.7）g比（19.3±1.8）g, t=2.62, P<0.05）］，对照组体重保持稳定。模型组小鼠死亡率为60%（6/10），富氢水组为10%（1/10），对照组未出现死亡（0/5）。提示富氢水能显著降低ANP小鼠的死亡风险。

二、富氢水对ANP小鼠皮肤溃烂的影响

ANP小鼠L⁃精氨酸腹腔注射部位出现皮肤溃烂现象，模型组发生率为50%（5/10），富氢水组为10%（1/10），对照组为0（0/5）。与模型组比较，富氢水组小鼠腹腔注射区域皮肤损伤明显减轻，其肿胀和破溃程度明显降低（图1）。

三、富氢水对ANP小鼠胰腺组织病理形态的影响

模型组小鼠胰腺炎性细胞浸润、组织充血水肿和坏死的发生率分别为100.0%（6/6）、100.0%（6/6）和66.7%（4/6），富氢水组分别为77.8%（7/9）、33.3%（3/9）和0（0/9），对照组分别为40.0%（2/5）、0（0/5）和0（0/5）。与模型组比较，富氢水组上述病理特征的发生率显著降低，炎性细胞浸润程度减轻，充血水肿现象明显减少，且未见组织坏死（图2）。

四、富氢水对ANP小鼠氧化应激及炎症反应相关标志物的影响

免疫组织化学染色结果（图3）显示，模型组胰腺组织HO1、SOD1、iNOS2、NOX2的蛋白表达量分别为42.00±17.89、42.00±13.04、76.00±15.17、57.00±30.74，富氢水组分别为76.00±15.17、86.00±5.48、46.00±33.62、35.00±16.96，对照组分别为76.00±5.48、73.00±13.04、43.00±19.24、32.00±5.70。模型组HO1和SOD1表达较对照组显著降低（t值分别为4.06、3.76，P值均<0.05），而富氢水组HO1和SOD1较模型组表达显著升高（t值分别为3.24、6.96，P值均<0.05）；模型组iNOS2表达较对照组显著升高（t=3.01，P<0.05），NOX2亦呈上升趋势，但差异无统计学意义，富氢水组较模型组iNOS2与NOX2表达均有所下降，差异亦无统计学意义。提示富氢水可能通过调节氧化⁃抗氧化平衡缓解ANP小鼠相关氧化应激损伤的作用。

模型组胰腺组织TGF⁃β、TNF⁃α的蛋白表达量分别为72.00±10.95、72.00±23.87，富氢水组分别为42.00±27.06、48.00±25.88，对照组分别为29.20±15.83和47.00±13.96。与对照组比较，模型组胰腺组织TGF⁃β表达显著升高（t=4.97，P<0.05），TNF⁃α亦呈上升趋势，但差异无统计学意义。富氢水组较模型组胰腺组织TGF⁃β与TNF⁃α的表达水平均有所降低，但差异无统计学意义。提示富氢水可能通过抑制炎症因子的释放在一定程度上缓解ANP相关的炎症反应。

 讨　论 

AP是一种由于胰酶异常激活和炎症反应导致的复杂疾病，其病程急剧且可能危及生命。传统治疗方法主要针对症状管理，但随着对其病理生理机制的深入研究，近年来涌现了多种潜在的治疗策略。AP的核心病理生理进展可概括为“胰酶异常激活→腺泡细胞钙超载→线粒体氧化应激→NLRP3炎症小体与NF⁃κB/p38⁃MAPK级联放大”。新近研究证实，氧化应激爆发不仅是胰腺坏死的首要驱动因子，更是炎症小体激活的必需信号，由此催生“靶向抗氧化⁃抗炎”联合干预理念。富氢水因其具有独特的抗炎、抗氧化及信号转导调节等特性，被视为精准打断上述正反馈环的新型干预手段。动物ANP模型病理特征主要为炎性细胞侵润、组织水肿充血及腺泡细胞坏死等，与人类重症急性胰腺炎相似，常用于模拟人类重症急性胰腺炎病程。本研究通过建立L⁃精氨酸诱导的小鼠ANP模型，系统评估了富氢水对ANP的治疗效果及其作用机制。结果显示，富氢水能够显著降低L⁃精氨酸诱导的ANP小鼠的死亡率，改善其生存质量，并有效减轻病理组织损伤，为重症急性胰腺炎的治疗提供了重要实验依据。

AP常伴有多种并发症，胰腺局部并发症有进行性胰腺坏死、胰腺水肿以及多器官功能障碍和全身炎症反应。腹腔注射L⁃精氨酸主要引发上述系统性并发症，但注射部位的局部溃烂未见报道。本研究采用腹腔注射L⁃精氨酸时予以生理盐水或富氢水，成功建立ANP模型后予富氢水灌胃，发现模型组小鼠腹部注射部位溃烂发生率高达50%，而富氢水组小鼠的溃烂发生率仅为10%，且体重下降幅度明显小于模型组。提示富氢水可能减轻L⁃精氨酸所致小鼠皮肤损伤。需要说明的是，该皮肤损伤主要源于L⁃精氨酸的局部化学刺激，而非急性胰腺炎本身的直接病理表现。

本研究证实富氢水对ANP具有显著保护作用的核心机制与调控氧化⁃抗氧化失衡及炎症反应密切相关。病理形态学观察表明，富氢水干预后小鼠胰腺组织的水肿、出血及坏死病变明显减轻，这与既往研究结论一致。进一步的免疫组织化学结果显示富氢水可显著上调抗氧化酶HO1与SOD1的表达，同时抑制iNOS2/NOX2介导的氧化应激反应，促使机体氧化应激指标逐步恢复；在炎症调控方面，富氢水能够有效下调TNF⁃α、TGF⁃β等关键炎症因子水平，而上述因子作为NF⁃κB通路的下游效应分子，直接参与ANP的炎症级联反应，提示富氢水可能通过阻断NF‑κB通路发挥作用。本研究结果验证了富氢水治疗ANP的有效性，揭示其通过调控炎症信号通路及氧化酶表达、减轻炎症与氧化应激损伤的潜在分子机制，为基于富氢水的治疗手段开发提供了重要理论支撑。