编者按
近日，上海市皮肤病医院/同济大学医学院光医学研究所王秀丽教授团队在《The Journal of Investigative Dermatology》杂志发表研究，揭示5-氨基酮戊二酸光动力疗法（ALA-PDT）治疗
Key Message
1. ALA-PDT能显著抑制严重痤疮患者、痤疮样小鼠模型及体外培养的皮脂腺细胞的脂质合成与分泌。
2.ALA-PDT可上调皮脂腺细胞中NR4A1的表达，且NR4A1在ALA-PDT 抑制脂质积累过程中起关键作用。
3.ALA-PDT通过抑制Akt信号通路，激活JunD，进而促进NR4A1转录，最终实现对脂质生成的调节。
研究背景与研究设计
痤疮是一种常见于青少年和年轻人的慢性炎症性皮肤病，全球发病率约为20.5%。严重痤疮不仅影响患者外貌，还可能导致永久性瘢痕，对患者心理造成较大压力。ALA-PDT已成为治疗严重痤疮的有效手段，但其具体作用机制尚未完全明确。皮脂腺功能异常在痤疮发病中占据关键地位，而NR4A1在脂肪酸代谢调节中意义重大，但其在痤疮和皮脂腺细胞中的作用此前未见报道。
本研究旨在探究ALA-PDT治疗痤疮的分子机制，重点研究NR4A1在其中的作用。研究人员通过对痤疮患者、痤疮样小鼠模型及人永生化皮脂腺细胞系XL-i-20进行实验，综合运用多种实验技术，如RNA测序、免疫组化、Western blot等，全面分析ALA-PDT对脂质生成、NR4A1表达及相关信号通路的影响。
研究结果——ALA-PDT抑制痤疮脂质生成
研究人员首先对比了严重痤疮患者和健康人的面部皮脂水平，发现痤疮患者面部皮脂水平更高（图1a）。分析以往基因芯片结果（GSE6475）可知，痤疮患者炎症和脂质合成相关基因表达上调（图1b）。为进一步研究，团队构建了痤疮样小鼠模型：在小鼠背部皮肤涂抹
图1 痤疮样小鼠模型的建立
a. 健康对照和痤疮患者面部皮脂分泌值直方图；b. 痤疮病变和非病变皮肤中差异表达基因的聚类点图，展示脂质合成和炎症情况；c. SKH-1小鼠背部痤疮样建模示意图；d. SKH-1小鼠和对照小鼠痤疮样病变的H&E染色和皮肤镜图像；e. SKH-1小鼠和对照小鼠痤疮样病变的BODIPY脂质染色；f. BODIPY染色强度定量；g. SKH-1小鼠和对照小鼠痤疮样病变中SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析。所有实验均重复三次，数据以均值±标准误表示，( P<0.05) ，( P<0.01) 。
接着，研究人员评估了ALA-PDT治疗效果。经过两次ALA-PDT治疗两周后，患者痤疮
在小鼠实验中，对造模小鼠左侧背部进行ALA-PDT治疗，24小时后，治疗部位红斑、肿胀，7天后炎症逐渐消退，皮损体积减小更为明显（图2e、f）。H&E染色显示，治疗后24小时真皮层有炎症细胞浸润，7天后逐渐减少（图2g）。BODIPY荧光表明，治疗后24小时和7天，皮脂生成减少（图2h），FASN和SREBP-1蛋白水平也下降（图2i）。在体外培养的XL-i-20皮脂腺细胞实验中，ALA-PDT处理后，细胞脂质含量呈剂量依赖性下降（图2k、l），FASN和SREBP-1蛋白表达下调（图2m）。这些结果证实，ALA-PDT能抑制痤疮患者、痤疮样小鼠模型和体外皮脂腺细胞的脂质生成。
图2 ALA-PDT抑制脂质生成
a. 痤疮患者治疗前和两次ALA-PDT治疗两周后面部皮脂分泌值直方图；b. 三位严重痤疮患者治疗前和ALA-PDT治疗24小时后痤疮病变的GSEA分析；c. 痤疮结节病变治疗前和ALA-PDT治疗24小时后FASN和SREBP-1的免疫组化染色；d. SKH-1小鼠双侧背部痤疮样建模示意图；e. SKH-1小鼠痤疮样病变在PDT前、PDT后24小时和7天的皮肤镜图像；f. SKH-1小鼠痤疮样模型在PDT前和PDT后1、3、5、7天的病变体积测量；g. SKH-1小鼠痤疮样病变在PDT前、PDT后24小时和7天的H&E染色；h. SKH-1小鼠痤疮样病变在PDT前、PDT后24小时和7天的BODIPY脂质染色；i. SKH-1小鼠痤疮样病变在PDT前、PDT后24小时和7天的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析；j. 未处理和ALA-PDT处理的XL-i-20皮脂腺细胞的GSEA分析；k. 未处理或ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞的BODIPY脂质染色；l. BODIPY染色强度定量；m. 未处理或ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析。所有实验均重复三次，数据以均值±标准误表示，( P<0.05) ，( P<0.01) ，( P<0.001) ，(P <0.0001) 。
研究结果——ALA-PDT上调皮脂腺细胞NR4A1表达
为探究ALA-PDT抑制脂质生成的分子机制，研究人员对未处理和ALA-PDT处理的XL-i-20皮脂腺细胞进行RNA测序，发现3023个差异表达基因，其中NR4A1显著上调（图3a、b）。qRT-PCR和Western blot结果显示，ALA-PDT处理后，XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1在mRNA和蛋白水平均上调，且呈剂量依赖性（图3c-e），同时细胞核中NR4A1定位增强（图3f）。
在体内实验中，免疫组化分析表明，ALA-PDT治疗后，人皮脂腺中痤疮结节的NR4A1表达增加（图3g、h）；小鼠痤疮样病变中，NR4A1在mRNA和蛋白水平也显著上调（图3i、j）。这表明，ALA-PDT可在体内外上调皮脂腺细胞NR4A1表达。
图3 ALA-PDT上调痤疮患者、痤疮样模型小鼠体内和体外皮脂腺细胞中NR4A1的表达
a. 基因表达火山图，红色表示ALA-PDT处理后上调基因，蓝色表示下调基因；b. 未处理和ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞中差异表达基因（DEGs）的热图；c. 未处理和ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1的相对mRNA水平，以GAPDH为对照；d、e. 未处理和ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1的相对蛋白表达；f. 未处理和ALA-PDT处理24小时后XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1在细胞核和细胞质中的亚细胞定位；g. 痤疮结节病变治疗前和ALA-PDT治疗24小时后NR4A1的免疫组化染色和定量；h. 未处理的痤疮小鼠模型和ALA-PDT处理24小时后NR4A1的相对mRNA水平，以β-actin为对照；i. 未处理和ALA-PDT处理24小时后痤疮小鼠模型中XL-i-20皮脂腺细胞NR4A1的相对蛋白表达。数据以均值±标准误表示，( P<0.05) ，(P <0.01) ，( P<0.001) ，(P <0.0001) 。
研究结果——NR4A1在ALA-PDT调节脂质积累中的关键作用
研究人员构建了NR4A1基因敲低和过表达的XL-i-20皮脂腺细胞。qRT-PCR和免疫印迹验证了敲低和过表达效率（图4a-g）。BODIPY染色显示，敲低NR4A1后，未处理的XL-i-20皮脂腺细胞脂质积累增加；ALA-PDT处理后，阴性对照细胞脂质积累减少，但敲低细胞仍高于对照（图4c、d）。同时，敲低NR4A1使SREBP-1和FASN蛋白水平升高（图4e）。而过表达NR4A1的细胞BODIPY荧光降低，脂质积累减少，SREBP-1和FASN蛋白水平降低（图4h-j）。这些结果表明，NR4A1在ALA-PDT抑制皮脂腺细胞脂质积累和分泌过程中起关键作用。
图4 ALA-PDT上调NR4A1表达并抑制脂质积累
a、b. NC或Sh-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1的RT-qPCR分析和免疫印迹分析；c. NC或Sh-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞在未处理或ALA-PDT处理24小时后的BODIPY脂质染色；d. BODIPY染色强度定量；e. NC或Sh-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞在未处理或ALA-PDT处理24小时后的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析；f、g. NC或OE-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞中NR4A1的RT-qPCR分析和免疫印迹分析；h. NC或OE-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞在未处理或ALA-PDT处理24小时后的BODIPY脂质染色；i. BODIPY染色强度定量；j. NC或OE-NR4A1慢病毒转染的XL-i-20皮脂腺细胞在未处理或ALA-PDT处理24小时后的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析。所有实验均重复三次，数据以均值±标准误表示，( P<0.05) ，( P<0.01) ，( P<0.001) ，(P <0.0001) 。
研究结果——ALA-PDT通过调节Akt信号通路调控NR4A1表达和脂质积累
已有研究表明，Akt磷酸化与NR4A1蛋白水平呈负相关，且ALA-PDT可抑制Akt磷酸化。研究人员发现，ALA-PDT处理后，XL-i-20皮脂腺细胞和小鼠痤疮样病变中磷酸化Akt蛋白水平降低，且随PDT剂量增加而更明显（图5a-d）。
为进一步探究三者关系，研究人员使用Akt抑制剂MK2206和激动剂SC79处理XL-i-20皮脂腺细胞。结果显示，MK2206单独处理降低了细胞脂质滴荧光，增加了NR4A1蛋白水平；ALA-PDT联合处理后，脂质积累进一步减少，NR4A1蛋白水平更高，SREBP-1等脂质调节蛋白水平更低（图5e-g）。而SC79预处理则减弱了ALA-PDT对脂质积累的抑制作用，逆转了NR4A1蛋白的上调，使FASN和SREBP-1水平升高（图5h-j）。这表明，ALA-PDT通过抑制Akt信号通路，上调NR4A1表达，抑制脂质积累。
图5 ALA-PDT通过调节Akt信号通路在体内外调控NR4A1并抑制脂质积累
a、b. XL-i-20皮脂腺细胞中磷酸化Akt（Ser473）蛋白表达水平的Western blot分析；c、d. 痤疮样小鼠模型中磷酸化Akt（Ser473）蛋白表达水平的Western blot分析；e. 用500 nM MK2206或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后再进行ALA-PDT处理的XL-i-20皮脂腺细胞的BODIPY脂质染色；f. BODIPY染色强度定量；g. 用500 nM MK2206或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后，未处理或ALA-PDT处理24小时的XL-i-20皮脂腺细胞的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析；h. 用10 µM SC79或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后再进行ALA-PDT处理的XL-i-20皮脂腺细胞的BODIPY脂质染色；i. BODIPY染色强度定量；j. 用10 µM SC79或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后，未处理或ALA-PDT处理24小时的XL-i-20皮脂腺细胞的SREBP-1和FASN蛋白表达水平的Western blot分析。数据以均值±标准误表示，( P<0.05) ，(P <0.01) ，(P <0.001) ，(P <0.0001) 。
研究结果——ALA-PDT通过抑制Akt信号通路激活JunD促进NR4A1转录
研究人员整合多个数据库预测调控NR4A1的潜在转录因子，经分析筛选出11个基因，其中JunD与Akt信号通路关系密切。实验发现，ALA-PDT增加了JunD和磷酸化JunD（P-JunD）蛋白水平；MK2206处理使二者表达升高，SC79处理则抑制了ALA-PDT诱导的JunD和P-JunD上调（图6c、d）。ChIP-qPCR结果证实，JunD能直接结合NR4A1启动子（图6e）。这表明，ALA-PDT通过抑制Akt磷酸化，上调JunD蛋白表达，促进NR4A1转录。
图6 ALA-PDT通过抑制Akt信号通路激活JunD并促进皮脂腺细胞中NR4A1转录
a. 由多个数据库预测的NR4A1潜在转录因子的Venn图构建的UpSet图；b. ALA-PDT处理与未处理的XL-i-20皮脂腺细胞的差异表达基因与NR4A1转录因子预测结果的Venn图；c. 用500 nM MK2206或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后，未处理或ALA-PDT处理24小时的XL-i-20皮脂腺细胞中JunD和磷酸化JunD（Ser255）蛋白表达水平的Western blot分析；d. 用10 µM SC79或E培养基（不含胎牛血清）预孵育1小时后，未处理或ALA-PDT处理24小时的XL-i-20皮脂腺细胞中JunD和磷酸化JunD（Ser255）蛋白表达水平的Western blot分析；e. 用抗JunD抗体进行的XL-i-20皮脂腺细胞中JunD与NR4A1启动子结合的ChIP-PCR分析，IgG作为阴性对照；f. ALA-PDT通过抑制Akt信号通路激活JunD并促进NR4A1转录，从而减少寻常痤疮中的脂质生成。数据以均值±标准误表示，(P<0.05) ，( P<0.01)
研究总结与展望
本研究揭示了ALA-PDT治疗痤疮的新机制：通过抑制Akt信号通路，激活JunD，上调NR4A1表达，进而抑制脂质生成。这一发现为痤疮治疗提供了新的理论依据，NR4A1有望成为治疗痤疮的潜在靶点，为优化ALA-PDT临床应用提供了方向。
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