前言

既往研究证实钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）对成人慢性肾脏病（CKD）、2型糖尿病（T2DM）、慢性心力衰竭（HF）有良好的治疗作用。不仅如此，近期发表在柳叶刀子刊《EBioMedicine》的一项研究表明，SGLT2i还可以降低糖尿病（DM）患者肾结石发生风险。

在细胞机制层面，自噬通路激活可能是SGLT2i肾保护作用的重要途径，而自噬调节可能对结石形成具有深远影响。该研究通过动物试验和临床研究，考察了SGLT2i预防肾结石的疗效，并进一步探讨了自噬减少肾结石的潜在机制。

研究背景

全球范围内肾结石发病率持续攀升，其中草酸钙（CaOx）结石最为常见，但其发病机制尚不完全明确。目前手术是治疗CaOx结石的主要手段，药物治疗效果不佳且患者依从性低。已有研究证实代谢综合征和糖尿病均与肾结石风险增加相关，降糖药物可能具有防治肾结石的潜力。

SGLT2i作为新型降糖药物，无论患者是否合并DM均表现出显著的心肾保护作用。SGLT2i的肾脏保护机制独立于其降糖作用，可能与减轻血容量负荷、降低氧化应激及改善肾小管氧合等有关。在细胞机制层面，SGLT2i可通过调控AMP活化蛋白激酶（AMPK）和雷帕霉素靶蛋白复合物（mTOR）来增强自噬，从而维持细胞完整性并保护肾功能。

研究方法

【动物试验】

实验采用八周龄雄性C57BL/6JNarl小鼠，随机分为3组（每组10只）：对照组、乙醛酸盐（GOX）组和GOX+DAPA（SGLT2i：达格列净）组。从第2天起，GOX组和GOX+DAPA组小鼠连续5天腹腔注射GOX（100mg/kg/天），每次GOX注射前30分钟给予DAPA。GOX+DAPA组连续6天口服灌胃给予DAPA（10mg/kg/天）。测量小鼠尿液和血清化学指标、观察肾脏结石形成情况、提取肾脏RNA进行实时PCR分析、进行蛋白质免疫印迹分析、免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察。为探究自噬在肾结石形成中的作用，联合使用DAPA与多种自噬调节剂评估其对肾结石的治疗效果（图1a）。

【临床研究】

利用台湾全民健康保险研究数据库进行回顾性队列研究，纳入2016-2020年间，535,404例（男性284,295例）使用SGLT2i或二肽基肽酶-4抑制剂（DPP4i）的40岁以上2型糖尿病患者，分为无肾结石病史和有肾结石病史两个队列。以DPP4i作为对照，分析SGLT2i使用与肾结石风险的关系，并评估同时使用自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）对该风险的影响（图1b）。

图1 自噬调节化合物联合治疗的实验方案

(a)雷帕霉素（Rapa）与达格列净（DAPA）在乙醛酸盐（GOX）诱导的草酸钙（CaOx）小鼠模型中的联合治疗实验设计。(b) 羟氯喹（HCQ）与达格列净（DAPA）在GOX诱导的CaOx小鼠模型中的联合治疗实验设计。

研究结果

【DAPA可抑制草酸钙肾结石形成，减缓肾损伤】

-GOX治疗组小鼠体重显著下降（p=0.0294），而GOX+DAPA联合治疗可缓解GOX引起的体重下降（图2a、b）。

-GOX组小鼠肾脏重量显著增加（p=0.0120），而GOX+DAPA联合治疗后肾脏重量恢复正常（p=0.0002）（图2c）。

-GOX组小鼠显示存在结石（平均评分2.375，发生率100%）（图2d）。值得注意的是，GOX+DAPA联合治疗完全消除了GOX诱导的肾结石（严重程度评分：0，发生率：0%）。

-通过分析尿液和血浆生化指标（图2f-m），发现GOX治疗显著降低小鼠尿钙（p=0.0127），但使尿草酸盐升高超3倍（p=0.0049），同时减少肾结石关键抑制剂——尿枸橼酸和镁的排泄。GOX还降低尿钾（p=0.0290，可能与尿枸橼酸相关）并显著酸化尿液（pH降低，p=0.0011），这些变化显著增加草酸钙结石形成的离子活度积（AP[CaOx]）（p=0.0227）。DAPA虽未显著影响尿钙，但有效降低尿草酸盐（p=0.0021）、增加尿枸橼酸（p=0.0084），从而降低AP[CaOx]（p=0.0232）。DAPA还逆转尿液酸化（pH升高，p=0.0033），促进钙-枸橼酸络合，在组织学和生化层面均显著改善草酸钙结石形成。

-肾功能分析显示，GOX组小鼠血浆尿素氮（BUN）及BUN/肌酐（CRE）比值较高，表明肾功能损伤较严重，而DAPA逆转了这种功能衰退（图2o、p）。值得注意的是，上述所有变化均与血糖水平无关（图2q）。

图2 达格列净（DAPA）对GOX诱导的草酸钙（CaOx）小鼠肾脏结石及尿液和血清生化指标的影响（每组n=10）

（a）DAPA在GOX诱导CaOx小鼠模型中的实验设计。（b）体重变化百分比（%）。（c）肾脏/体重比值。（d）钙化评分。（e）肾脏偏振光显微镜观及H&E染色（上两图比例尺=100μm；下两图比例尺=400μm）。（f）尿钙浓度。（g）尿草酸盐浓度。（h）尿柠檬酸盐浓度。（i）尿镁浓度。（j）尿钾浓度。（k）尿液pH值。（l）尿钠浓度。（m）尿尿酸浓度。（n）AP（CaOx）评分。（o）血浆尿素氮（BUN）。（p）血浆BUN/肌酐比值。（q）血浆葡萄糖。

数据以均值±标准误表示，统计学分析采用Fisher's LSD检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

（注：H&E：苏木精-伊红染色，AP：过饱和指数，BUN：血尿素氮，Cr：肌酐）

【DAPA可改善肾结石诱导的炎症反应和细胞凋亡】

-肾损伤标志物：GOX组小鼠Kim1基因（一种跨膜糖蛋白，在受伤的肾小管中急剧上调）表达升高，而GOX+DAPA联合组Kim1基因表达降低（图3a）。

-炎症调控：炎症标志物（Tnfα、Il6、Ccl2）、巨噬细胞标记物（Emr1、Cd68）、炎症小体介质（Nlrp3、Il1b）在GOX组小鼠中均呈上升趋势，但经DAPA干预后显著改善（p<0.05）（图3b-h）。

-结石风险基因：与肾结石风险相关的Spp1基因在GOX组小鼠中升高，经DAPA治疗后下降（图3i）。

-纤维化指标：纤维化相关基因（Tgfb1、Col1a1、Col3a1）在GOX组小鼠中上调，经DAPA处理后回调（图3j-l）。

-蛋白水平验证：免疫印迹显示GOX组小鼠NFκB、NLRP3和ASC蛋白表达增加，DAPA可逆转该效应（图3m），细胞凋亡相关蛋白（cleaved Caspase3和PARP）在GOX组上调，经DAPA治疗后下调。

图3 达格列净（DAPA）对肾损伤、炎症、巨噬细胞浸润、炎症小体活化、肾脏纤维化通路及凋亡信号的影响（每组n=10，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶Gapdh为内参基因）

（a）肾损伤分子1（Kim1）表达。（b）肿瘤坏死因子α（Tnfα）表达。（c）白细胞介素6（Il6）表达。（d）趋化因子配体2（Ccl2）表达。（e）巨噬细胞表面标志物（Emr1）表达。（f）溶酶体相关膜蛋白（Cd68）表达。（g）NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（Nlrp3）表达。（h）白细胞介素1β（Il1b）表达。（i）骨桥蛋白（Spp1）表达。（j）转化生长因子β1（Tgfb1）表达。（k）胶原蛋白1α1（Col1a1）表达。（l）胶原蛋白3α1（Col3a1）表达。（m）炎症小体及凋亡相关蛋白的免疫印迹分析。

数据以均值±标准误表示，统计学分析采用Fisher's LSD检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

（注：Gapdh/Hprt：常用内参基因，Kim1：肾小管损伤标志物，NLRP3：炎症小体核心组分，Spp1：参与结石形成的基质蛋白）

【肾结石损害自噬体降解过程，DAPA可逆转这一反应】

-自噬标志物变化

GOX组：LC3B-II蛋白（自噬过程的核心标志物）水平及LC3B-II/I比值升高，同时自噬受体SQSTM1/p62积累（图4a），提示结石模型虽诱导自噬体合成，但p62清除受阻，自噬流受损。

DAPA干预组：LC3B-II、p62水平及LC3B-II/I比值均下调，表明达格列净能有效清除累积的LC3B-II和p62蛋白。

-上游自噬通路调控

GOX组：磷酸化ULK1（p-ULK1）和Beclin-1（BECN1）表达增加（图4b），二者是自噬体形成的关键启动因子；ATG5蛋白水平有升高趋势，但ATG7无变化。

DAPA干预组：虽未显著改变ATG5-ATG12和ATG7水平，但下调p-ULK1和BECN1，结合LC3B-II与p62的减少，证实达格列净可改善结石导致的自噬流障碍。

-AMPK/mTOR信号通路调控

AMPK通路：GOX组磷酸化AMPK（T172）及总AMPK水平均升高；DAPA虽未改变p-AMPK绝对值，但提高p-AMPK/AMPK比值（图4c），提示其进一步激活AMPK以促进自噬。

mTOR通路：GOX组磷酸化mTOR（S2448）及p70S6K水平升高，表明结石激活mTOR（自噬负调控因子）；而DAPA可抑制mTOR和p70S6K的磷酸化，逆转GOX的抑制作用。

-肾结石炎症部位与自噬阳性区域共定位
采用LC3B标记自噬体（红色），NLRP3标记结石相关炎症小体（绿色）。首先，主要分布于肾皮质的DAPA靶点（白色）在三组中表达水平无差异。其次，由结晶物质激活的NLRP3水平在GOX组显著升高，而DAPA联合治疗可逆转这一现象。NLRP3信号集中于髓质区域，被扩张的肾小管环绕，并与草酸钙（CaOx）晶体沉积密切共定位。第三，GOX组LC3B斑点数量增加，尤其在NLRP3阳性肾小管附近较多，表明CaOx晶体沉积周围存在自噬体聚集（图4d）。这些结果表明：GOX会增强自噬流阻滞，该现象与CaOx结石形成密切相关，而DAPA给药可缓解此过程。

图4 DAPA对肾脏自噬的影响（每组n=10）

(a) LC3B和p62的免疫印迹分析；(b) p-ULK1/BECN1/下游ATG蛋白；(c) AMPK/mTOR相关蛋白；(d) 肾脏LC3B（红色）、NLRP3（绿色）和SGLT2（白色）免疫荧光染色，DAPI核复染显示为蓝色。上图放大倍率×20，下图×400。比例尺为10 μm；(e) 溶酶体生物合成相关蛋白免疫印迹分析；(f) p-TFEB与TFEB免疫印迹分析；(g) 泛素化条带；TFEB下游基因表达：(h) Tfeb，(i) Lamp1，(j) Lc3b，(k) Ctsf。

数据以均值±标准误表示，统计学分析采用Fisher's LSD检验。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

【GLT2i有效降低肾结石发生及复发风险】

-无肾结石病史患者（初发结石风险）：SGLT2i组结石发生率：13.26例/1000人年，DPP4i组结石发生率：15.41例/1000人年，发生率比（IRR）：0.86（95%CI：0.82–0.90，图5a-b）。

-有肾结石病史患者（复发风险）：SGLT2i组复发率：127.24例/1000人年，DPP4i组复发率：132.41例/1000人年，IRR：0.96（95%CI：0.93–0.99，图5a-d）。

图5 SGLT2i与肾结石风险及HCQ关联的全国数据库分析

(a) 有/无肾结石病史患者中，SGLT2i对比DPP4i的肾结石发病率比率。SGLT2i与DPP4i使用者肾结石风险的累积发病率曲线：(b) 无肾结石病史患者（ITT分析）。(c) 有肾结石病史患者（ITT分析）。(d) 无肾结石病史患者（AT分析）。(e) 有肾结石病史患者（AT分析）。

研究结论

SGLT2i达格列净通过增加尿枸橼酸、镁离子和pH值，同时降低草酸盐水平，有效抑制了GOX小鼠的草酸钙结石形成。尽管GOX小鼠肾脏中自噬活动增强，但p62蛋白的积聚提示自噬流受损，而达格列净可通过下调mTOR（雷帕霉素靶蛋白）、调节AMPK并恢复自噬流改善自噬功能。联合使用雷帕霉素可维持达格列净的抑石作用，而联合羟氯喹（HCQ）则会抵消该作用。临床研究数据最终证实，SGLT2i可降低肾结石风险，但若患者过去一年内使用过HCQ，这种保护作用即消失，提示HCQ可能削弱SGLT2i的肾脏保护效应。该研究结果为SGLT2i用于治疗肾结石疾病提供了重要依据，强调了SGLT2i是降低肾结石风险的潜在药物选择。

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