作者：冯兰兰，马磊，空军军医大学第一附属医院；高学军，延安大学附属医院
癫痫是神经系统常见的疾病之一，其中颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）最为常见。大多数抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）主要针对神经元电压门控离子通道和γ-氨基丁酸能受体来降低神经元的兴奋性。30%~40%的癫痫病人在规范化的AEDs治疗后，癫痫发作仍然无法得到控制，称为药物
星形胶质细胞的功能异常在癫痫中具有重要作用，其特异性蛋白的表达在癫痫发作时发生改变。星形胶质细胞对神经元兴奋性的调节的一个重要机制是通过连接蛋白（connexins，CXs）形成类似于合胞体样的功能网络并与神经元突触网络相重叠。此外，CXs半通道（hemichannels，HCs）的过度激活也可促进癫痫的发生。
研究表明，星形胶质细胞CX43在癫痫病人脑组织和
1. 星形胶质细胞CX43 的HCs/GJCs
CX43作为人类21种连接蛋白家族之一，在中枢神经系统的神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞以及星形胶质细胞中均有表达，但主要在星形胶质细胞中表达。CX43具有四个跨膜结构域，包括两个细胞外环，一个细胞质环以及位于细胞内的N端和C端尾部。6个CX43亚基通过寡聚作用形成Cx43-HCs，允许ATP、
但是星形胶质细胞Cx43-HCs的开放受到不同机制的严格调节，包括细胞内游离Ca2+浓度增加以及CXs翻译后的磷酸化、羰基化、s-亚硝基和细胞酸碱度的改变等，在生理情况下，星形胶质细胞Cx43-HCs大多处于关闭状态。而病理情况下，如
目前认为，病理情况下Cx43-HCs过度开放可加剧细胞死亡，是决定细胞损伤传播的重要因素，而磷酸化是Cx43-HCs关闭的主要调控机制，因此CX43-HCs被认为是病理孔。但CX43-HCs在生理过程中也可发挥作用。研究表明，生理条件下位于基底外侧杏仁核的星形胶质细胞CX43-HCs的开放是记忆巩固的基础，可能与胶质递质释放调节突触相关。
此外，星形胶质细胞CX43-HCs通过增强自身活性，增加谷氨酸和ATP的释放，参与小鼠急性和慢性约束后的应激反应。星形胶质细胞CX43-HCs通过调节d-丝氨酸的释放参与前额叶皮层N-甲基-D-天冬氨酸受体依赖性突触的可塑性。另外，两个相邻细胞的CX43-HCs 对接形成GJCs，星形胶质细胞GJCs 通过电连接形成功能网络，参与中枢神经系统的K+和谷氨酸的缓冲与调控，促进
2. 星形胶质细胞CX43 与癫痫
2.1 癫痫病人脑组织CX43 的表达及功能改变
Naus等在1991年利用RNA印记分析法，首次发现难治性癫痫病人和脑肿瘤急性癫痫发作病人的新皮层CX43 mRNA表达增加。近年来，在结构性病因相关的癫痫病人的术后脑组织标本中，例如伴海马硬化的TLE病人手术标本、局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia，FCD）ⅡB型的癫痫病人手术标本等，同样存在星形胶质细胞CX43的转录产物和蛋白表达的增加。
尽管，CX43 表达研究具有重要意义，但全面理解癫痫发作/癫痫诱导下CX43的改变，还需深入研究与其功能紧密相关的翻译后修饰和功能偶联等参数。在伴海马硬化的TLE病人手术切除的海马组织中发现CX43的蛋白表达水平没有改变，而Ser255和Ser368位点的磷酸化增加，这两个位点的磷酸化可以导致CJCs的开放概率降低（Ser255）和单一电导降低（Ser368），最终导致星形胶质细胞的偶联被破坏，从而参与癫痫的发生。
此外，在星形胶质细胞瘤中，CX43具有复杂作用，既参与肿瘤微环境的构成，增强肿瘤向周边脑组织侵袭的能力，又与肿瘤相关癫痫的致痫灶密切相关。研究表明，
由于癫痫病人组织标本的研究具有复杂性、癫痫异质性强、受多种因素影响，CX43异常表达分析多基于难治性癫痫病人组织，其可用性有限，受癫痫类型、病人年龄、患病年龄、服用抗癫痫药物类型和数量等多因素差异影响。因此，CX43表达变化与癫痫发作的直接关联尚不明确。同样，人体组织中星形胶质细胞偶联丧失是否诱发癫痫发作的疑问，需探究癫痫脑组织的早期病理变化，而人体组织标本只能从疾病的晚期慢性状态中获得，更深入的探索研究需借助模拟人体疾病环境的动物模型。
2.2 癫痫动物模型中CX43的表达及功能改变
海马组织在癫痫发生的过程中具有关键作用，其具有广泛的GJCs网络。Motaghi等研究发现，雄性Wistar大鼠经匹罗卡品（pilocarpine，PILO）诱导
同样，Liu等通过PILO诱导的癫痫持续状态SE模型与GJCs抑制剂
Andrioli等研究PILO诱导SE后24 h内大鼠脑神经元CX36和星形胶质细胞CX30、CX43 mRNA的表达水平，结果显示，CX43和CX30 mRNA水平在SE发作后24 h新皮质区域和海马以及大多数丘脑区域显著降低，而CX36 mRNA没有表现出明显的变化，同时相应脑区发现了进行性神经元死亡。因此，癫痫动物模型CX43异常表达与癫痫密切相关，且与癫痫病人组织的研究结果相一致。而星形胶质细胞CX43在癫痫动物模型中表达出现矛盾结果，可能与动物模型的年龄、诱导癫痫发作的方法、癫痫发作类型、持续时间以及所选取的脑组织区域不同相关。在动物模型中，诱导癫痫发生的潜伏期的CX43的表达具有更充足的证据阐明二者之间的因果关系。
Altas等研究发现，Nedd4-2作为E3泛素连接酶，可以调控神经元网络活动，并且Nedd4-2缺失或错义突变可能引发家族性癫痫；而Nedd4-2通过影响星形胶质细胞Kir4.1和CX43表达，调节细胞离子通透性和GJCs活性，影响γ-振荡神经元网络活性。
Men等研究瞬时受体电位香草素4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）在PILO 诱导的小鼠SE 后CXs表达调节中的作用，发现SE后TRPV4蛋白水平在海马区显著增加，并且与CX43蛋白水平的增加存在时间上的相关性，而TRPV4拮抗剂HC-067047能够延长PILO诱导的癫痫发作潜伏期并降低PISE制备的成功率，同时显著减弱CX43蛋白水平的增加，表明TRPV4可能通过上调CX43表达参与癫痫的病理生理学过程。因此，星形胶质细胞CX43的异常表达和调控是促进癫痫发生的潜在原因。未来更需要构建靶向CX43蛋白敲除或缺陷的动物模型以进一步探索癫痫发生的复杂机制。
2.3 星形胶质细胞CX43参与癫痫的可能机制
目前的研究现状（癫痫病人、动物模型）表明星形胶质细胞CX43可能通过以下机制在癫痫的发生过程中发挥作用。一方面，星形胶质CX43通过GJCs形成的星形胶质细胞功能网络在许多方面影响神经元的兴奋性和同步性。首先，星形胶质功能网络具有空间K+缓冲作用，这一过程由局部K+平衡电位和神经胶质合胞体更负的膜电位之间的差异驱动，过量的神经元释放的K+通过Kir4.1通道被星形胶质细胞被动吸收，通过GJCs网络分布并在K+较低的位点释放。当偶联功能异常时，局部K+增加，神经元的兴奋性和去极化效应增强。
其次，GJCs偶联减少同样会导致Na+在星形胶质细胞的胞质积累，使得由Na+梯度驱动的星形胶质细胞质膜谷氨酸转运蛋白清除突触期间过量谷氨酸的能力下降，从而增加了兴奋性神经递质的功能。此外，星形细胞胞质增加的Na+可以触发Na+/Ca2+交换机制的逆转，导致星形胶质细胞Ca2+摄取增加，同样增加了与Ca2+相关的异常的神经胶质的释放，有助于神经元的同步化活动的产生和扩散。
最后，胞质K+/Na+的积累还会增加水分子的流入，增加了星形胶质细胞肿胀程度，导致细胞外空间体积减少并增加了离子和神经递质的浓度，会对癫痫发生产生促进作用。同样，星形胶质细胞网络对于高能量需求的神经元的能量（ATP等）供应和转运也至关重要，是影响癫痫活动维持的重要因素。因此，急性期GJCs偶联减少可能造成K+/Na+和谷氨酸的缓冲减少，促进癫痫快速发作，但由于能量供应不足又会产生延迟癫痫发作的抑制作用。
另一方面，在各种应激条件下，例如脑缺血、炎症、氧糖剥夺、细胞外低钙时，CX43的HCs开放并释放谷氨酸、ATP和D-丝氨酸等增强神经元的兴奋性和同步性，也可能具有促癫痫作用。
3. CX43 抑制剂在癫痫中的作用
3.1 非选择性抑制剂
星形胶质细胞CX43阻断剂的非选择性抑制剂主要有甘珀酸、
Ross等发现甘珀酸还可降低大鼠海马脑片自发性痫样活动的频率。甘珀酸也可减少颞叶癫痫病人大脑皮层切片中应用4-氨基吡啶产生的自发同步事件。Volnova等基于大鼠海马切片研究中表明，甘珀酸阻滞GJCs相关星形胶质细胞合胞体可能会影响体外星形胶质细胞癫痫活动的形成和癫痫发作的发生。奎宁作为一种强效GJCs阻滞剂，可抑制暴露于GABA（B）受体拮抗剂的大鼠海马切片中的GABA能发作样事件。
奎宁在TLE病人的新皮层中也可以观察到与甘珀酸相似的作用。并且，奎尼丁也可消除4-氨基吡啶诱导的大鼠丘脑皮质切片中的癫痫样活动。除了这些体外模型的研究外，体内实验也表明GJCs参与了癫痫样活动。Wu等在红藻氨酸快速点燃大鼠癫痫模型中发现，甘珀酸、奎宁和奎尼丁逆转微管相关蛋白（microtubule-associated protein- 2，MAP- 2）和突触素（synaptophysin，SYP）的过度表达，使得癫痫发作活动传播受到抑制。此外，甘珀酸还可显著降低戊四唑（etrazale，PTZ）诱导的大鼠癫痫样活动的光谱功率和振幅。
同样，在PTZ诱导的大鼠癫痫模型中，奎宁可减轻癫痫发作严重程度和平均癫痫发作分期。奎宁还可通过降低癫痫样棘波的振幅和频率来抑制癫痫样活动。这些非选择性的抑制药物虽然可以在动物模型癫痫发作过程起到一部分作用，由于CX43在组织中表达广泛，而非选择性抑制药物特异性和选择性均较差会造成其他组织（心脏、肺部等）潜在损伤，其在癫痫中的应用还有待进一步的探索。
3.2 模拟肽
针对星形胶质细胞CX43通道的特异性靶向AED的研究发现新的途径，即以CXs蛋白特定序列相同短肽作为工具，特异性抑制CX43的功能，干扰GJCs的偶联，这类连接蛋白胞内、外环特定结构的类似物，即EL模拟肽，常见的类型有GAP26、GAP27、以及GAP19。Braet 等表明GAP26 可以选择性抑制CX43HCs从而抑制ATP的释放，阻断三磷酸肌醇诱发的融合内皮细胞间的Ca2+波，并且通过光漂白后荧光恢复检测并非是阻断GJIC 的结果。
Torres等表明Cx43-HCs通过在细胞外间隙释放ATP参与星形胶质细胞Ca2+传播。GAP27是第一个在体外测试其对癫痫活动影响的Cx43模拟肽。Samoilova等表明7 d龄大鼠的海马切片中，GAP27抑制自发性反复癫痫活动，但产生抑制作用所需的时间>10 h，远远超出了干扰CX43-HCs所需的时间（<30 min），可能是干扰了HCs对接和形成新的功能性的GJCs的能力。
由于CXs的胞外序列具有保守性，GAP26/27也可能抑制神经元或血管内皮中的其他CXs。而GAP19是衍生于CX43细胞内L2结构域的合成九肽，可以特异性的干扰细胞质环和羧基末端尾部之间的分子内相互作用，并且对GJCs、pannexin通道均不造成影响。
由于该序列位于细胞内的C末端结构域，不同CXs蛋白之间的序列各不相同，使得GAP19作用于CX43以外的连接蛋白机率大大降低。并且为了提高GAP19的细胞膜的穿透性，可与
Walrave等在
3.3 小分子抑制剂
D4是一种新开发的有机小分子化合物，即（R）-2-（4-氯苯基）-2-氧代-1-苯基喹啉-2-羧酸乙酯，可以通过选择性抑制CX43-HCs，可有效地减少病理性肌肉萎缩；还可以通过减少神经炎症来减少小鼠抑郁样症状。Guo等在颞叶PILO小鼠模型中使用D4来阻断星形胶质CX43-HCs，发现在预先给予D4 的情况下，利用200~300mg/kg的毛果芸香碱诱导SE后，动物7 d存活率由40%明显升至70%。
D4主要通过以下几个方面在癫痫中发挥作用：D4预先给药可以减轻TLE诱导的神经炎症；D4在发生SE后给药可以缓解TLE介导的神经炎症，逆转SE发生后活化的星形胶质细胞和小胶质细胞；D4在体内可以快速衰减电痉挛；D4在体内外实验中均可抑制CX43-HCs的活性。通过人工构建CX43模型，可获得D4中苯甲酰、苯基和喹诺酮类芳香基团在空间上与mCx43 GJC 构象中Trp4、Leu-7和Leu1 残基侧链重叠，使D4 优先结合到Cx43-HCs，而不是Cx43/GJCs或Cx39HC。
D4在小鼠癫痫模型实验过程中可以通过口服灌胃给药，与人服药方式类似。D4从胃部吸收后进入循环系统，到达身体的各个部位，具有较好依从性。D4是一种很有前景的癫痫治疗策略，但是D4是否可以穿透脑血屏障进入中枢神经系统，以及在中枢系统是否有较好的药物生物利用度，未来应对D4如何穿透大脑以及其代谢物如何在体内介导其抗惊厥作用进行更深入的研究。
综上所述，星形胶质细胞CX43在癫痫发生的过程发挥重要作用，并且CX43-HCs的选择性抑制已成为一个有巨大潜力的AEDs的靶点。相比于星形胶质CX43-GJCs的抑制，CX43-HCs的选择性抑制可以减少对其它组织的损伤。CX43胞内结构域保守性较差，模拟肽特异性结合CX43胞内结构域可以有效地避免干扰其他CXs的功能。
由于模拟肽的血浆半衰期短，口服利用度不足，临床的实际应用有待进一步探索。对小分子物质D4代谢产物的进一步研究可为明确其参与癫痫治疗和控制提供更好的实验证据。研发新的、更有效的、耐受性更好的药物仍具有挑战性，而癫痫治疗的最终目标不仅是使病人免于癫痫发作，更要提升病人的生活质量。希望未来关于星形胶质CX43在癫痫中的机制的探索能为临床诊疗提供更好的理论依据。
来源：冯兰兰,高学军,马磊.星形胶质细胞连接蛋白43在癫痫中的研究进展[J].中国临床神经外科杂志,2024,29(11):690-695.DOI:10.13798/j.issn.1009-153X.2024.11.012.
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