作者：张魏怡，栾永，宋辛叶，大连医科大学附属第一医院麻醉科
国际疼痛学会将
NP的产生涉及到了多种病理生理机制。针对其发生机制，运用基因手段可能获得良好的治疗效果。基因治疗是将遗传物质转移到靶细胞，纠正错误、突变的基因或者特异位点修饰来治疗和预防疾病。病毒载体作为主要的基因递送系统，利用自然能力将外源基因递送到宿主靶细胞。
不仅有较高的转染效率，还表达稳定。在许多领域，基因治疗已经进行了多项临床实验。在疼痛领域，临床前研究已将病毒载体携带治疗基因用于缓解NP，这些研究为之后的临床试验提供一些可行的方案，也奠定了坚实的基础。然而，该领域还存在着诸多挑战，其中，免疫源性一直是主要障碍。本文将概述目前已用于NP治疗的病毒载体种类、携带疼痛相关基因及其用于临床治疗的局限性。
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
1.NP机制概述
NP不是由组织伤害激活的神经末梢产生的，而是由神经本身的损伤或病变引起的，可影响7%～10%的人群。分为外周NP（如
神经损伤后，背根神经节和受损伤的轴突末梢上的钠离子通道表达增加，神经纤维自发放电，与疼痛极具相关性。某些钾离子和钙离子通道也在NP中发挥着作用。损伤后的神经，也许会造成神经传递障碍，这就等同切断了神经与末端器官之间的联系，而神经营养因子能够作为其中的信号分子参与调控。在脊髓上行通路和下行抑制通路中，伤害性信号的传递受到细胞内因子，例如
2.病毒载体的基因治疗
1） 基因治疗的概述
将遗传物质有效转移到靶细胞中，用于治疗疾病的方法称为基因疗法。基因疗法是一种特殊管理疼痛的工具，根据启动子、转基因、载体来调节合适的治疗策略。基因治疗将可以调整的基因靶向递送到细胞核产生蛋白质产物，为病人提供遗传信息，从而达到治疗疾病或者预防疾病的目的。基因治疗的方法包括所需基因的基因替换、对功能不正常的突变基因失活、编辑病人基因组和将外源基因引入靶细胞防止疾病的产生。
2） 病毒载体
现如今，已经拥有了许多病毒载体递送基因的方法。病毒对基因转导提供较高的传递效率，比物理化学转染方法更加有效，并且单次剂量就足以长时间维持，基本不会对非靶细胞产生毒性。病毒载体去除非必须或者有害的基因，保留必须的结构序列，这种复制缺陷病毒颗粒通过病毒表面蛋白与靶细胞相应受体结合，引发细胞内吞作用，进而根据宿主转录机制进行长期的基因表达。
病毒载体拥有天然感染细胞的能力，可以将治疗基因运送至靶细胞，这使得病毒载体在治疗过程中极具吸引力。治疗NP较为常见的病毒载体包括：逆转录病毒(retrovirus,RV)、腺病毒(adenovirus,Ad V)、腺相关病毒(adeno-associated ovirus,AAV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、慢病毒(lentivirus,LV)。病毒载体分为整合型病毒载体（如RV、LV、AAV、疱疹病毒）和非整合型病毒载体（如AdV）。整合型病毒载体本身没有复制能力，整合到人类
(1)RV载体：RV属于包膜RNA病毒。RV载体是将RV RNA基因组的核心部分(gag、pol、env)大部分或全部除去，不影响其他部分的活性。保留病毒颗粒的包装信号，缺失病毒颗粒包装蛋白基因，使载体不能提供RV复制所需要的蛋白质，从而感染细胞不能复制病毒。RV载体的包装容量大于AAV载体，但小于HSV载体。RV载体作为基因转移成熟的工具，能够有效感染多种细胞类型，将载体携带的外源基因整合到分裂的靶细胞基因组中，因而可以在子细胞中传递，进行长期外源基因的表达。但RV载体只转导分裂细胞，并且整合后可能会导致插入诱变而引发癌变。
(2)AdV载体：AdV载体以双链无包膜DNA形式存在，基因组含35～36 kb，通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后AdV基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合到宿主细胞基因组中。瞬间表达、转基因效率高、时间长、遗传稳定性、易于大规模生产和大量包装DNA是其优点。但载体衣壳蛋白含量丰富，通常引起较强的免疫应答，可能导致炎症反应，限制了在体内的基因表达持续时间。
(3)AAV载体：利用天然存在的AAV改造后形成的人工转基因载体是AAV载体。AAV是一类单链线状DNA，自然复制缺陷的非包膜病毒，是非致病性的细小病毒，与人类任何疾病无关。AAV载体传递的基因整合到病人基因组中，在体内具有极高的感染效率和安全性。将基因插入到唯一的病毒元件，反向末端重复序列（病毒剩余部分；是基因组复制和包装到衣壳中所需），可能是免疫原性不强的原因。AAV载体容量小于5 kb，限制了治疗基因的长度，因此需要考虑调控元件来选择合适的递送基因。
(4)HSV载体：HSV是包膜的双链DNA病毒。HSV载体在周围神经系统的感觉神经元中具有天然的嗜神经性和神经侵袭性，可通过皮肤或者黏膜传播，进行轴突运输，逆行转运，将基因递送到背根神经节神经元中，最终治疗NP。HSV基因组中去除即刻早期基因的突变体，使载体正常运输到互补细胞中高滴度繁殖，不会进入到非互补细胞的裂解周期，在体内建立一个持续存在的潜伏状态。HSV还具有大包装容量，并且克服了插入诱变的局限性，容易培养治疗所需滴度。
(5)LV载体：LV是RNA病毒，属于逆转录病毒科的一个属。LV载体可以将外源基因整合到病人的染色体上，达到持久性表达的效果。LV载体的优点包括低免疫原性、广泛的组织嗜性、稳定整合到宿主基因组中。第一代LV载体存在很大一部分艾滋病病毒基因组，有辅助基因（vif、vpr、vpu and nef；不是生长所必需）和调控基因（tat and rev；复制所必须）。第二代LV载体去除了辅助基因，提高了安全性。第三代LV载体是将LV成分分开构建到两个质粒上，降低恢复野生型病毒的可能。LV载体来自
3.基于病毒载体治疗NP
1） 神经递质
谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)是一种催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的酶。GABA是中枢神经系统最主要的抑制性神经递质，对调节疼痛感知至关重要。在NP的情况下，GAD的活性可能减少，导致GABA的产生下降，从而减弱了抑制性信号，增强了疼痛信号的传递。GABA的增加能够提高抑制性突触传递，这意味着在疼痛通路中，传递疼痛信号的神经元被更多抑制。这会导致疼痛信号的上行传导通路减少。
GABA的增加还能减少中枢神经系统的整体兴奋性，病人对疼痛的感知将会减少。GABA不仅在疼痛信号的上行传导通路中起作用，还涉及到疼痛的下行抑制途径。例如，脊髓水平的GABA能神经元可以抑制
在基因治疗中，通过向受损的神经系统组织或特定的疼痛通路介导GAD基因（GAD65或GAD67：是合成抑制性神经递质GABA的酶）的表达，可以增加该区域GABA的产生，从而减轻疼痛。这种策略可能特别适用于因GABA能系统功能障碍而遭受慢性疼痛的病人。Tadokoro等将携带GAD65的AAV载体靶向递送在坐骨神经损伤小鼠模型中，实现了2～3个月的长效镇痛。并且小鼠、猪和非人灵长类在载体递送后长达2～13个月中没有检测到不良反应（如运动无力、感觉丧失）。
另一项研究使用了HSV载体来评估GAD67在外周艾滋病病毒gp120诱导的大鼠NP中的治疗潜力。结果表明，皮下接种表达GAD67的HSV载体能够减轻艾滋病病毒相关NP中的机械性痛觉过敏。此外GAD67的抗痛觉过敏作用可能通过恢复GABA能递质传递功能实现。GAD67对重建GABA能递质传递功能起到关键作用。结果提示GAD67可能作为一种治疗NP的目标，为开发与艾滋病病毒相关的周围NP的治疗方法提供了新思路。目前对GAD基因治疗的安全性和有效性的研究仍然是在进行中的，特别是在临床应用上。
2） 阿片类受体/肽
背根神经节中的阿片类受体/内源性阿片类配体与疼痛初级传入神经元反应调节密切相关，是疼痛回路调节的基础。直接调控内源性阿片类肽用于镇痛，降低了外源性阿片类药物耐受的机会，可减少阿片类药物的用量。在有害的刺激下，脊髓背角内脑啡肽能神经元通路兴奋释放脑啡肽，抑制了谷氨酸能神经元的传递，降低痛觉感受。
病毒载体多携带由前脑啡肽在神经元中编码的内源性阿片类肽（如脑啡肽、强啡肽和β-内啡肽），参与多种神经系统调节机制。例如，编码μ阿片受体和前脑啡肽基因组合的HSV载体递送到小鼠脊神经结扎模型中，进而增强神经损伤后外周μ阿片受体表达，通过对初级传入信号传导的影响来减少NP相关行为。研究结果显示，增加阿片受体和内源性阿片类配体脑啡肽的初级传入表达可以减轻机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。
Nav1.7是一种电压门控钠离子通道，它在调节疼痛感知中起着关键作用。特别是在周围神经系统中，Nav1.7的表达增强与一些疼痛症状的出现有关。脑啡肽与阿片受体结合可能导致钠通道的磷酸化，从而改变其功能，减少钠离子的流动性，降低神经细胞的兴奋性。
Chattopadhyay等发现在糖尿病大鼠中，脑啡肽的持续产生减少了大鼠疼痛的伤害行为。在痛性糖尿病神经病变中，体内HSV载体装载的脑啡肽阻止了背根神经节中Nav1.7表达的增加。靶向递送内源性阿片类药物作用于阿片受体，增强外周阿片类镇痛，对逆转NP是有益的。HSV递送方式的应用提供了一种可转化的治疗策略。
3） 细胞因子
神经损伤后免疫细胞释放抗炎因子（白细胞介素-10、白细胞介素-4、
脊髓的星形胶质细胞活化可以释放神经营养因子，它具有保护神经的作用。神经营养因子被发现能够对中枢敏化产生影响。中枢敏化是指在持续痛觉刺激下，脊髓和大脑的痛觉神经元变得更加敏感，导致疼痛感知的增强和持久化。神经营养因子能够通过调节神经元的活动来影响中枢敏化的过程，从而在减轻疼痛方面显示出潜在的治疗作用。
Kim等使用AAV载体进行传递基因，通过经孔硬膜外注射法成功地将AAV载体递送到靶向的脊神经节细胞中。通过Western印迹等实验技术，验证了重组AAV病毒表达的标记蛋白是成功表达的。研究中同时使用了GAD65、白细胞介素-10和神经营养因子三个基因进行治疗。
结果表明，三个基因的同时表达有明显的协同效应，能够显著减轻神经痛症状，调节神经细胞活性，显著优于任何两个基因的组合。表明同时靶向多个基因进行联合治疗也能够取得更好的效果。全身应用药物进行疼痛治疗，能够产生较多不良反应，而靶向细胞因子的治疗，最大程度减少了不良反应的发生。
4） 离子通道或受体
各种离子通道、受体在神经损伤后表现出过度兴奋状态，促进疼痛信号传导，并且在背根神经节中显示上调。离子通道阻滞剂和受体阻滞剂由于在选择性方面受到抑制，会脱靶产生不良反应。而选择特定的疼痛通道和受体进行基因阻滞，能够增加特异性和减少不良反应。通过基因沉默敲低技术降低离子通道的过度兴奋、抑制介导疼痛的受体的编码或者直接下调炎症因子。RNA在NP的研究方面具有广阔的前景。
背根神经节中使用RNA干扰可能是潜在的治疗方式，例如小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)和短发夹RNA (short hairpin RNAs,shRNA)参与基因沉默现象。钠离子通道（Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9）作为兴奋性细胞静息电位和动作电位的基础，被认为是镇痛治疗的潜在研究靶点。SCN9A是编码Nav1.7的一种基因。将si RNA-SCN9A直接转染到神经元细胞中可以使Nav1.7的表达下调，但si RNA具有不稳定性并且容易降解。
Fu等在显微镜下注射LV-siSCN9A作用在化疗药物
4.临床研究与局限性
病毒载体已经在疫苗、癌症、中枢神经系统疾病和
病毒载体会引发免疫介导的排斥反应、基因错误插入、遗传毒性和细胞毒性等风险。例如，RV病毒身为整合载体进行随机整合，有插入突变和重排的潜在危险。AAV病毒具有多种血清型（衣壳），人类体内可能会有预先存在的抗体，这也许是基因治疗的障碍。基因治疗临床病例中，由于载体整合，抑癌基因失活或原癌基因被激活可造成癌变。考虑每种病毒载体与疾病可能会产生的风险和益处，设计无害且无不良反应的基因疗法是成功的关键。
5.结论
NP的基因治疗是一个高度专业化的领域，涉及将特定的基因传递到病人的体内，以改变疼痛信号的传递、处理或感知。基于病毒载体的方法是通过使用改造后的病毒将治疗基因传递到目标细胞。这些病毒载体已经被设计为无法复制或引起疾病，但可以高效地将遗传物质运送到宿主细胞中。总体而言，根据NP的机制精准进行靶向的基因治疗展现出了显著的疗效潜力，这在多项前沿研究中已经得到了体现。尽管如此，我们仍需警觉于此类治疗策略的复杂性和潜在风险。
来源：张魏怡,栾永,宋辛叶.基于病毒载体的神经病理性疼痛靶向基因治疗[J].中国疼痛医学杂志,2024,30(10):764-768.
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