作者：李东炎，姜智雯，刘新，吉林大学中日联谊医院口腔科
口腔恶性肿瘤是一种侵袭性癌症。早期可能出现广泛性淋巴结转移，主要发生在40~60岁的嗜烟嗜酒患者中。口腔恶性肿瘤作为头颈部肿瘤最常见的种类之一，其发病率占全身恶性肿瘤发病率的8.2%~9.9%。而在口腔恶性肿瘤中，口腔鳞状细胞癌发生率占90%以上。
早期发现的口腔鳞状细胞癌变(OSCC)患者的平均5年总生存率高达的80%，而晚期的OSCC病人的平均5年总生存率则维持在20%~40%之间。因此，
目前，临床治疗中口腔病损组织活检为诊断口腔癌的“金标准”，然而病理活检属于有创性操作，部分患者依从性较差。因此，作为非侵入性、无创的液体活检越来越被患者认可，其针对液体中的生物标志物进行检测，可提示不同疾病的发生。
从最初的血液液体活检到现在逐渐发展至对于唾液、尿液、脑脊液等的深入研究。对比其他体液，唾液具有更易获取、检测价格低廉及无创操作等优点，使得患者依从性更好。
唾液作为人体三大体液之一，是由口腔唾液腺分泌的一种液体，分泌唾液的腺体包括颌下腺、腮腺、舌下腺以及其他小唾液腺。分泌唾液量由多至少分别为：下颌下腺60%，腮腺占25%，而小唾液腺则占5%~10%，舌下腺占5%。
唾液不仅可以提供多种基因信息，还可以提供有关人体内微生物、局部组织以及其他部位感染病毒的RNA 和DNA。虽然唾液检测具有获取方便、非创伤性、受试者基本无不适反应以及安全性高等优点，但是在对全唾液样本进行检测时发现唾液成分易受采集方式、昼夜差异等影响，从而导致唾液样本被污染或者发生变性，以及存在其他蛋白质被蛋白酶干扰其降解过程的情况。
研究发现，唾液外泌体相对于唾液中的蛋白质和RNA具有更好的稳定性，能有效解决上述问题。因此，近年来有大量关于将唾液外泌体作为早期诊断口腔恶性肿瘤的生物标志物的研究，本文仅对此研究进行综述。
1.唾液外泌体的组成和生物学特征
外泌体(exosomes)最先在绵羊网织红细胞中被发现，是由多种类型细胞主动分泌的30-150nm囊泡状小体，属于细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)系统。电镜下观察外泌体由磷脂双分子层包裹，其内容物多为可进行信息传导的蛋白质、DNA、RNA、酶和脂类分子等。
外泌体转运蛋白质、核酸和脂质分子以达成细胞间通信的作用，发挥了促进血管新生、调控细胞凋亡、抗肿瘤免疫应答及抗原提呈等生理功能。根据赵泽亮等的研究表明，EV与肿瘤的发生发展密切相关，它可以介导肿瘤微环境与其肿瘤细胞之间发生双向串扰，即EV可以参与修饰内容物促进肿瘤增殖与转移。
唾液外泌体很大程度上兼具外泌体的特质，双层脂质膜保护内部的生物活性物质：蛋白质、核酸和脂质等。蛋白质是唾液外泌体最主要的组成部分，其中包括位于外泌体表面用于维持外泌体结构的，如：微管蛋白、肌动蛋白、微丝结合蛋白等；用于膜蛋白标志物的，如：四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)、水通道蛋白(AQP5)等；用于膜融合及物质转运的，如：膜连蛋白、脂筏特征蛋白等。
除了蛋白质，唾液外泌体中还携带发挥生物效应的核酸，如：miRNA、mRNA、circRNA及piRNA等。含量较少的脂质分子在唾液外泌体中也起到重要作用，例如胆固醇、神经鞘磷脂和
2.唾液外泌体的分离提取
为了探究唾液外泌体与早期诊断口腔恶性肿瘤的相关性，需要以提取高纯度唾液外泌体为前提。目前，研究人员常用的分离提取方法包括：超速离心法、亲和法和超滤法等。由于不同方法的技术特性和不同的应用场景，可能导致分离出的唾液外泌体纯度差异。
根据TANG等的研究发现，针对同一类标本采取不同的分离提取方式得到有共同交集的miRNA588个，还有200个miRNA仅在各自提取方式中存在，证实了不同分离提取方案所得到的外泌体纯度有差异。传统的超速离心法经过不断改进，现已成为超80%研究人员首选的分离方式。超速离心法因无需考虑分离试剂的污染，获取所需样本量多，方法相对成熟，常受到研究人员青睐。然而超速离心法易造成唾液外泌体结块，甚至有可能导致唾液外泌体损伤破坏。
ZERINGER 等研究发现，离心时间与所获得的外泌体量呈正相关，但当离心时间超过4小时，会明显增加可溶性蛋白质杂质。亲和法利用外泌体表面特有的抗原，研究人员通常选择外膜表面含量高的蛋白以固相抗体吸附外泌体表面抗原，从而提取出外泌体。这种方式理论上讲最具有特异性，可以通过不同种类的抗体对不同来源的外泌体表面抗原进行筛选。
相比于超速离心法，亲和法需要的样本量为超速离心法样本量1/6，而实验时间仅为其1/16。然而，分离出的外泌体生理学功能是否会被固相抗体影响，至今仍未有定论。相比上述两种方法，超滤法具有更加简单快速的优势。超滤法使用不同膜孔大小的超细纳米膜来分离外泌体，漏过小直径微小囊泡，截留大直径粒子。
这种方式在处理大量样本时优势更加明显，可以设计不同口径的纳米膜来分选不同来源的外泌体。但是，外泌体通过膜孔时的切割压迫损伤不可避免，为此研究人员设计切向流过滤法改善外泌体损伤。相比于其他研究项目，对于外泌体研究的首要之处是提取稳定、高纯度的外泌体，但目前尚无一种方式可以兼具高纯度分离提纯并且适用于多种应用场合，外泌体的分离提取流程仍然需要进一步完善。
3.唾液外泌体早期诊断OSCC
3.1 唾液外泌体中的mRNA
外泌体是一种重要的生物学特征，它们可以存在于唾液中，并且通过其双层结构，可以有效地保护外分泌体的内部物质，从而降低唾液的复杂性，为临床医生提供更加精准、稳定的诊断信息，从而有助于早期发现癌症。随着时间的推移，越来越多的科学家们开始重视唾液外分泌体的研究，并将它们视为一种理想的生物标志物。
研究唾液外泌体可以为口腔癌的早期诊断提供新的见解，并且具有巨大的发展潜力。mRNA 包含了宿主和口腔微生物的基因表达信息，可以用来诊断疾病。尽管仅仅占细胞总RNA的2%~5%一小部分，但它们的种类繁多，代谢活性强，可以反映机体的生理和病理状态。
多项研究证明，mRNA 可作为稳定分子存在于唾液中，用超速离心法提取分离全唾液的外泌体，微阵列分析显示，509个mRNA 核心转录产物相对稳定地存在于外泌体中。外泌体不仅可以保护RNA 在体外不被酶降解，还能够作为载体将RNA 运送到靶细胞中，发挥特定的作用。在实验室环境中，荧光标记的唾液外泌体能够与口腔角质细胞进行交流，从而将其中的遗传特征和功能转录至角质细胞，从而影响其基因表达水平。mRNA在唾液外泌体中的表达可以用于诊断疾病，这是一个重要的发现。
3.2 唾液外泌体中的miRNA
miRNA是一种无编码蛋白质，它通过降解或抑制特定基因的信使mRNA，来调控基因表达，从而实现基因表达的调控。它是一种短链RNA，由内源性基因编码，具有重要的生物学功能。最新研究显示，癌细胞有能力通过特异性地将特定的miRNA封装到外泌体，从而实现对肿瘤的有效抑制和促进其生长的作用。外泌体中的miRNA 表达模式与肿瘤组织中的表达模式更为接近，因此，将其作为生物标志物具有更高的可靠性，可以更有效地指示肿瘤的发生和发展。
GAI等通过荷沉淀技术分离唾液细胞外囊泡，通过芯片技术和qRTPCR检测miRNA的差异表达，结果显示，与对照组相比，miR-512-3P和miR-412-3p 在OSCC患者唾液EV中上调，ROC曲线表明二者对OSCC诊断具有较好的鉴别能力，可能作为潜在的生物标志物。
张学武等验证外泌体miR-512-3p通过下调Gas2促进TSCC细胞增殖。COON等研究证实miR-365在细胞外泌体或细胞外囊泡的存在，且miR-365很可能成为口腔鳞状细胞癌外泌体中的潜在生物标志物。唾液外泌体miR-24-3p是一种潜在的新型OSCC诊断生物标志物，HE等报道miR-24-3p可通过靶向PER1维持OSCC细胞增殖，ROC曲线分析AUC为0.738(95%CI：0.589~0.886，P=0.02)、敏感性和特异性分别为64.4%和80.0%，对OSCC也有较好的鉴别能力。
3.3 唾液外泌体中的DNA
与外泌体中大量的RNA 相比，一些研究人员开始关注基因组DNA 和线粒体DNA(mtDNA)，这些研究的优势在于，它们与肿瘤细胞的DNA 具有高度一致性，这表明外泌体DNA 可以作为一种有效的生物标志物，用于检测致癌性突变。唾液外泌体存在的DNA 是循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA 是一种由肿瘤细胞产生的游离DNA，它来源于凋亡的肿瘤细胞、坏死的肿瘤细胞以及它们的外排物，这些DNA 携带着肿瘤特有的突变，并且可以被循环系统有效地利用。
ctDNA不仅存在血液中，也存在于其他体液中如唾液中，唾液基因组分析，ctDNA70%来自宿主，30%来自口腔微生物群，可用于液体活检。通过唾液腺超滤、被动扩散或主动转运，ctDNA可以从局部部位进入血液，携带原发肿瘤的信息，由于稀释和污染较小，唾液ctDNA的分析比血液中结果更具敏感性。WANG等在一项研究中提出在早期口腔癌唾液中检测ctDctDNA的敏感性为100%。
3.4 唾液外泌体中的蛋白质
研究发现，患口腔恶性肿瘤者的唾液外泌体不管从尺寸或是数量上来说，都要远远高出正常人的唾液外泌体，患者的唾液外泌体可通过简化细胞间信息传导过程来促进肿瘤的增殖与转移。Zlotogorski等人研究发现口腔恶性肿瘤患者的唾液外泌体中CD63含量增高，而CD9和CD81的含量显著降低。
在细胞粘附和调节细胞运动功能中，CD9和CD81起到了重要作用，其含量降低可促进肿瘤细胞的迁移，与EV促进肿瘤细胞增殖、迁移学说相符合。在2015年，Winck等研究人员首次对口腔恶性肿瘤患者和正常人的唾液外泌体进行蛋白质质谱分析。在纳入检测的381种蛋白质种，发现8种蛋白质在对照组和病例组中有明显差异，证实唾液外泌体中的蛋白质可以作为口腔恶性肿瘤的生物标志物。
4.总结与展望
综上所述，唾液外泌体可以作为早期诊断口腔恶性肿瘤的生物标志物之一，也对口腔恶性肿瘤的治疗有一定指导意义。相比于其他液体活检，唾液收集有着诸多优势，例如：收集简单、患者几乎无痛苦、保存简便、安全可靠，而且还带有丰富的生物学信息。通过近年的相关研究，人们在唾液外泌体中发现了很多与口腔恶性肿瘤有关的生物学标志物，例如：mRNA、miRNA、DNA和蛋白质等，这对于早期诊断口腔恶性肿瘤有着重大意义。
目前仍需解决的问题是，如何分离提取高纯度、稳定性高的唾液外泌体，用以深入研究方便推广临床应用。相信随着唾液外泌体的生物学标志物功能越来越被重视，唾液外泌体研究逐渐完善与发展，与其相关的疾病也会得到更为系统化的诊治，为广大患者带来福音。
来源：李东炎,姜智雯,刘新.唾液外泌体在口腔恶性肿瘤诊断作用中的研究进展[J].中国实验诊断学,2023,27(08):991-994.
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