作者：张师前，王星语，山东大学齐鲁医院
1背景
子
2HPV检测技术和基因分型
如何诊断一个“真正”的HPV非相关性子宫颈癌是目前亟需回答的问题，HPV检测阴性是否就一定可以确诊HPV非相关性子宫颈癌？一项Meta分析对1990—2010年间的30 848例浸润性子宫颈癌进行了分析，结果表明随着HPV检测敏感性的提升和组织类型分类的进一步明确，HPV阳性诊断率从85.9%提升至92.9%，这也就意味着既往诊断中可能存在一些“假HPV非相关性子宫颈癌”［6］。因此可以推测，目前的HPV检测结果显示阴性未必一定就意味着该子宫颈癌患者为HPV非相关性。HPV检测结果阴性可能与以下因素有关：（1）HPV非相关性肿瘤（真阴性），如某些腺癌和少数鳞癌亚型。（2）HPV致病整合过程中HPV基因组丢失。（3）分子检测未能包括病毒基因类型。（4）所使用的诊断方法无法检测到。（5）误诊为原发性子宫颈癌（即转移或原发性子宫体肿瘤累及子宫颈）。
2.1 HPV检测技术 目前所采用的HPV检测技术敏感度均较高，阴性预测值可达97.9%～99.3%［7］，但HPV检测受标本采集、核酸提取方法、引物和内部对照等诸多因素影响，这些均可能引起假阴性结果。美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于子宫颈癌筛查、HPV检测的技术包括病毒DNA扩增、mRNA扩增以及信号放大系统。PCR是HPV基因检测中最常用的技术，大多选取HPV基因组中最保守的L1基因作为引物探针的杂交靶区，这些基于PCR技术的HPV检测试剂，具有高敏感度和特异度。如检测试剂中设计的引物和探针不能特异与靶标基因结合，则会显示为假阴性［8］。与DNA扩增相比，信号放大法的敏感度更低，病毒载量较低时可能会引起假阴性结果。此外，病毒基因组的降解、缺少内部对照也会增加假阴性的可能［9］。
HPV假阴性还与采样过程相关。从坏死或炎症区域采集取样有可能会导致取样不足、样本中混有血液或润滑剂，样本储存时间过长也会影响检测的准确性［10］。
2.2 靶向HPV DNA片段丢失 大多数基于PCR的检测只扩增HPV病毒L1区域，如果病毒在整合过程中L1区域丢失，则可能导致假阴性结果［11］。HPV基因整合至宿主细胞后，E6/E7 mRNA表达占比增加，因此基于检测E6/E7 mRNA表达技术的假阴性率更低［11］。
2.3 子宫颈继发性恶性肿瘤 继发于其他部位的子宫颈恶性肿瘤，也有可能被“诊断”为HPV非相关性子宫颈癌。一项研究纳入371例术前活检为子宫颈癌的研究，手术分期后发现有31例第二代杂交捕获技术（HC2）检测，其中21例最终病理证实为其他部位恶性肿瘤转移至子宫颈［12］。
不同HPV检测技术的原理、引物互有不同，敏感性和特异度也存在差异。有学者建议甄别HPV非相关性子宫颈癌需联合多种不同HPV检测技术［12］。当传统HPV检测方法均为阴性时，采用高通量测序等其他分子技术可协助诊断特定基因型的HPV感染，cDNA测序可提示是否存有病毒转录。有证据表明，PCR检测为HPV阴性的子宫颈鳞/腺癌患者，仅有48%～57%的HPV深度测序结果仍为阴性［13］，因此推荐对初筛为HPV阴性的子宫颈癌患者进行基于不同检测原理的HPV复核，从而提高“真性”HPV非相关性子宫颈癌诊断的准确性。
3HPV非相关性子宫颈癌的病因学及分子特征
HPV非相关性子宫颈癌的致病机制尚不清楚。有研究发现HPV相关性和HPV非相关性子宫颈癌的基因表达存在差异［3，14］，如细胞增殖标志物（PCNA和Ki-67）、肿瘤抑制蛋白（如p53、p16、p14、p21和p27）、原癌基因（如EGFR、c-myc和c-Erb2）表达互有不同［15］，可能预示二者之间的发病机制不尽相同。
Nicolás等［16］报道，HPV阴性子宫颈癌p53免疫染色异常（p53abn）的比例明显升高，表明p53突变与HPV非相关性子宫颈癌的肿瘤失调控、增殖转移相关。HPV相关性子宫颈癌的细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制蛋白如p16、p14、p27表达增加［17］，也可考虑作为HPV感染的替代标志物用以鉴别诊断。
p53调控WIG-1基因编码转录因子，后者可与异质
有研究对高危HPV E6/E7mRNA阳性和阴性的子宫颈癌组织样本的miRNA表达进行了探索，结果发现，高危HPV E6/E7mRNA阴性子宫颈癌组织样本中，miR-9下调［20］，miR-21和miR-155上调［21］，提示miRNA调节机制与HPV E6/E7蛋白相关。
癌症基因组图谱（TCGA）研究网络报道，HPV非相关性子宫颈癌中包括携带CpG岛高甲基化（CIMP）低聚集区亚群，平均启动子甲基化较低，通常CIMP低聚集区亚群多见于健康子宫颈上皮组织［3］。功能表观遗传学研究表明，HPV相关和HPV非相关性子宫颈癌FOXA2基因的表达存在明显差异，HPV阳性患者DNA甲基化水平升高，FOXA2基因则呈低表达［3］。HPV非相关性子宫颈癌NF-κB、P53和MAPK信号激活水平较低，上皮-间充质转化（EMT）mRNA较高，载脂蛋白B mRNA编辑酶APOBEC低频率突变，伴有KRAS、ARID1A和PTEN突变［3］。
Liu等［14］对HPV相关性和非相关性子宫颈癌的17种差异性表达基因进行研究，结果发现，有7种基因在HPV非相关性子宫颈癌细胞和组织中的表达水平显著升高，其中MEX3A和TTYH3基因与HPV非相关性子宫颈癌患者的总生存期相关，可能作为HPV阴性子宫颈癌治疗的新靶点。
Park等［21］根据HPV E6/E7mRNA转录状态，将子宫颈癌分为HPV活动性和HPV非活动性两类。HPV非活动组的HPV E6/E7mRNA转录与较低的DNA甲基化相关，根据突变图谱，PTEN、p53、CTNNB1、AKT、ARID1A和ARID5B等驱动基因突变独立于APOBEC途径。
HPV非相关性子宫颈癌的发生机制，流行观点以“打击和病毒逃逸”理论（Hit and Run Viral Theory）解释HPV非相关性子宫颈癌的病毒基因组缺失。“打击和病毒逃逸”理论认为，一旦病毒感染引起足够的细胞突变，肿瘤的发生发展就不再依赖于病毒蛋白的表达或转录，肿瘤进展过程中表现为病毒的“丢失［22-24］”。
有证据表明，E6/E7致癌基因启动致癌过程，随着时间的推移和突变的积累，病毒基因的转录不再是必要条件［23］。有研究提出，“打击和病毒逃逸”致癌理论也可通过表观遗传失调产生永久性改变。致癌基因整合、染色质重塑进而影响转录调节、DNA修复和感染细胞的永久性表观遗传学改变，如E7 HR-HPV肿瘤蛋白激活DNA甲基转移酶1（Dnmt1）的活性改变［25］。在“打击和病毒逃逸”的过程中，病毒基因组在肿瘤浸润前期短暂存在，浸润前期病变HPV的持续感染可能是HPV非相关性子宫颈癌在病毒“逃逸（Run）”之前所必须的“打击（Hit）”过程［25］。最近有研究对3个HPV非相关性子宫颈癌浸润前病灶进行分析，发现其中2个样本显示弥漫性p16ink4a阳性，提示其与HPV相关性病变的模式相似，标本中未检测到RB基因或编码p16ink4a蛋白的CDKN2A基因的体系或胚系突变，该研究结果进一步支持“打击和病毒逃逸”理论［26］。
4HPV非相关性子宫颈癌的前驱病变
子宫颈鳞状上皮内病变（SIL）与子宫颈鳞状细胞癌密切相关，其中高级别鳞状上皮内病变（HSIL）为子宫颈鳞癌的癌前病变。2020年版《WHO女性生殖器肿瘤分类》将子宫颈鳞癌/腺癌分为HPV相关性和HPV非相关性，但并未将癌前病变予以区分。HPV非相关性子宫颈癌是否与HPV相关性子宫颈癌一样，存在前驱病变？有研究对474例子宫颈锥切标本进行分析，发现有3例子宫颈上皮内病变标本、6例子宫颈鳞癌标本的32种HPV DNA及14种HR-HPV mRNA检测结果均为阴性。该研究认为，HPV非相关性子宫颈癌的癌前病变为高度分化的角化上皮内增殖（类似于高分化的外阴上皮内瘤变）、未分化的基底样上皮内病变（偶有p16ink4a块状染色，类似于HSIL）［27］。鉴于目前相关的研究报道较少，HPV非相关性子宫颈癌的癌前病变仍有待进一步研究。
5HPV非相关性子宫颈癌的常见病理类型
5.1 HPV非相关性子宫颈鳞癌 约有5%～7%的子宫颈鳞癌为HPV阴性，临床表现、组织病理特征难以与HPV相关性子宫颈鳞癌鉴别［16］。大体病理可表现为息肉样或浸润性，组织病理包括角化型、非角化型、乳头状型、基底型和疣状型。免疫组化p16阴性是诊断的必要条件，推荐采用不同检测原理的HPV分子检测方法进行检测。目前对HPV非相关性子宫颈鳞癌的遗传学研究较少。
5.2 子宫颈胃型腺癌 有研究对胃型腺癌进行基于PCR原理的HPV检测，结果均为阴性［28］。胃型腺癌是第二位次常见的子宫颈腺癌，约占子宫颈腺癌的10%［29］。症状多为大量阴道水样分泌物，由于肿瘤的高度浸润性生长，最明显的体征为子宫颈增大但无明确肿块。子宫颈腺体小叶状增生（LEGH）和胃型原位腺癌是子宫颈胃型腺癌的前驱病变。胃型腺癌的预后较差，5年生存率为30%～43%［30］。
5.3 子宫颈透明细胞癌 仅有25%～40.4%的子宫颈透明细胞与HPV感染相关［11］。子宫颈透明细胞癌的常见症状为异常阴道流血。非DES暴露相关的子宫颈透明细胞癌的发病机制尚不明确，有观点认为可能源于子宫颈的子宫内膜异位症［31］；管状内膜化生认为是DES暴露相关透明细胞癌的前驱病变［32］。有报道认为，DES暴露相关子宫颈透明细胞癌的预后好于非DES暴露患者，FIGOⅠ/Ⅱ期患者的5年生存率为81.5%，10年生存率达57%［33］。
5.4 子宫颈中肾管腺癌 子宫颈中肾管腺癌罕见，具有高侵袭性，早期即可转移，总体预后较差。有研究对子宫颈中肾管腺癌进行了HPV基因分型，发现7例患者均为HPV阴性［34］。子宫颈中肾管腺癌起源于正常或增生的中肾管残迹，通常发生于子宫颈的外侧至后部，可为浸润性或膨胀型外生性生长，一般很少累及整个子宫颈，大约70%的患者诊断时为ⅠB期，复发率为32%，平均复发间隔为24个月，平均生存时间为50个月［35-36］。
5.5 子宫颈子宫内膜样腺癌（ENAC） 仅有0～27%的ENAC中可以检测到HPV，起源于鳞柱状交界的ENAC中均检测到HPV ［37］。子宫颈上段内膜和子宫下段来源的ENAC为HPV阴性［38-39］。一项对409例子宫颈腺癌的研究显示，依据2014年WHO诊断标准，41%的患者诊断为ENAC，当采用国际子宫颈腺癌分类标准（International Endocervical Adenocarcinoma Criteria and Classification ，IECC）对同一批患者进行诊断，则仅有1.1%的确诊率［29］。有学者认为ENAC可能是由子宫颈的内膜异位症恶变而来［40］。
6HPV非相关子宫颈癌的临床转归
早期子宫颈癌（伴有淋巴脉管间隙浸润的ⅠA1期至ⅠB2期、ⅡA1期）的一线治疗是根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术，根据最终病理结果是否存在中高危因素确定后续补充治疗；局部晚期子宫颈癌（ⅠB3期、ⅡA2～ⅣA期）的标准治疗是同步放化疗。晚期子宫颈癌（ⅣB期）则以铂类为基础化疗的姑息治疗。由此可见，子宫颈癌的初始治疗基于临床、影像和病理结果，而非组织学类型、基因组改变或HPV相关与否。目前，HPV非相关性子宫颈癌的治疗依据多参考HPV相关性子宫颈癌的临床证据。部分研究结果表明，HPV非相关性肿瘤的预后较HPV相关性肿瘤更差［41］，但迄今尚无前瞻性证据评估HPV非相关性子宫颈癌患者的临床转归，是否需要对HPV非相关性子宫颈癌选择独立的治疗策略仍需进一步探讨。
一项纳入136例子宫颈癌（包含鳞癌和腺癌）的回顾性队列研究显示，14例HC2阴性患者，通过PCR复测后显示8例为HPV非相关性子宫颈癌，结果提示HPV非相关子宫颈癌的无病生存期更短；多变量分析结果显示，HPV状态是子宫颈癌患者的预后因素；HPV非相关性子宫颈癌多见于腺癌，部分非角化型鳞状细胞癌也为HPV阴性［42］。
另有回顾性研究分析了HPV阴性与肿瘤结局之间的关系。在一项包括248例患者（手术治疗108例，放化疗140例）的研究中，18.5%为HPV非相关性子宫颈癌；多变量分析显示，与HPV相关性子宫颈癌相比，HPV非相关性子宫颈癌的无病生存率更差［43］。一项研究对214例子宫颈癌（包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌或神经内分泌癌等病理类型）进行回顾性分析，应用反向杂交法进行HPV基因分型和p16免疫染色，结果发现HPV非相关性肿瘤占10%；与HPV相关肿瘤相比，HPV非相关肿瘤患者淋巴结转移率更高，无病生存期和总生存期更差；多变量分析表明，FIGO分期和淋巴结转移与肿瘤的不良预后相关［16］。
最近，一项基于预后生物标志物的多中心回顾性研究，依据国际子宫颈腺癌标准和分类系统（IECC），对464例ⅠB期子宫颈腺癌进行分析，多变量分析显示，HPV阴性与较差的无复发生存率有关；与预后相关的其他相关因素包括淋巴脉管间隙浸润和淋巴结转移［44］。
有研究对37例HPV阴性、FIGOⅠ～Ⅳ期初诊子宫颈癌样本（包括鳞癌和腺癌）再次检测发现，只有半数病例确认为HPV非相关性，患者的5年肿瘤特异性生存率较差［45］。一项系统回顾和荟萃分析对2838例子宫颈癌患者进行二次分析，结果显示，与HPV非相关肿瘤患者相比，HPV相关性肿瘤患者的总生存率和无病生存率更高［46］。该研究的局限性在于异质性较高，不同研究的HPV检测方法和组织来源不同［46］。
目前的研究结果多显示，HPV非相关性子宫颈癌的预后更差。但相关证据等级不高，多为回顾性研究，样本数量较少，且HPV非相关子宫颈癌的诊断标准尚未统一。不可否认的是，初始治疗前确定HPV状态对预后判定具有指导意义，有助于个性化治疗和随访监测，但针对于HPV非相关性子宫颈癌的具体治疗策略目前仍无统一的意见。
7未来研究方向
随着HPV检测技术的发展，HPV阴性子宫颈癌患者有逐渐下降趋势，但即使是通过不同的检测方法（包括深度测序），仍存在HPV非相关性子宫颈癌的研究报道。HPV非相关子宫颈癌可能为独立的生物学亚群，表现为FIGO分期较晚、预后较差。HPV非相关性子宫颈癌的无进展生存期和总生存期较低，推测目前的“标准治疗”未必适宜于这一特殊群体，寻求新的治疗手段是未来需要关注的重点。
HPV非相关性子宫颈癌具有独特的分子特征，不同于HPV相关性肿瘤生物学行为，信号通路的改变独立于病毒感染，主要表现为PTEN、KRAS、p53、CTNNB1、ARID1A和ARID5B的改变，期待进一步评估这些蛋白是否可作为HPV非相关性子宫颈癌的肿瘤标志物，为靶向治疗提供借鉴。Banister等［47］提出，基于HPV非相关性肿瘤的体系突变，PI3K/mTOR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂可能有助于提高治疗的应答率。HPV非相关性子宫颈癌对免疫检查点抑制剂（如PD1/PD-L1抑制剂）的反应率可能较差。KEYNOTE-028试验和CHECK MATE-358试验表明，TCD8+浸润性淋巴细胞（TILS）和PD-L1高表达型HPV相关性宫颈鳞癌，能够获益于免疫检查点抑制剂治疗［48］。不过Chen等［49］的研究发现，PD-L1在HPV相关性和非相关性子宫颈腺癌中的表达无显著差异。
8结语
不同于HPV相关性子宫颈癌，HPV非相关性子宫颈癌可能是一种独立分子特征的肿瘤类型，以p16缺失及p53、KRAS、ARID1A和PTEN等基因突变为特征。WHO建议通过HPV检测和p16免疫染色将子宫颈癌分为HPV相关性和HPV非相关性，但具体的诊断标准仍不明确，如何排除“假阴性”是诊断的难点，寻求新的标志物是未来的研究方向。HPV非相关性子宫颈癌病理学亚型为腺癌、鳞腺癌及少部分鳞癌，早期即出现淋巴结受累，转移范围更广泛，肿瘤学结局更差，需探讨新的治疗策略以面对HPV非相关性子宫颈癌的较差预后。目前尚无前瞻性研究评估基于HPV状态的不同干预措施对临床预后的影响，也没有基于HPV状态的特殊治疗手段。未来需要更多的相关研究用以支持HPV非相关性子宫颈癌的临床结局，评估相关治疗的总体应答率，探索新的生物标志物，以期寻找到更为准确的预后评价体系。
参考文献略。
来源：张师前，王星语.人乳头瘤病毒非相关性子宫颈癌的有关问题［J］.中国实用妇科与产科杂志，2023,39(7)：728-732.
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