作者：哈尔滨医科大学附属第一医院骨科   刘昊阳

骨肉瘤，一种骨组织恶性肿瘤，其结缔组织能直接诱导产生肿瘤骨或骨样组织，常发生于管状骨，例如股骨下端及胫骨上端，且预后不良；主要发生于青少年，在儿童恶性肿瘤中发生率为5%。近40年来，从手术、治疗和放射治疗方面的最新进展来看，骨肉瘤患者的5年存活率，已从不足20%上升到70%。张清等统计的10年数据证明，患者一旦出现远处组织转移，平均生存时间一般<1年。所以有必要进一步进行骨肉瘤基因水平的研究。近30年来，一些LncRNA逐渐被发现在骨肉瘤组织中有不同的表达和影响，LncRNA是没有编码蛋白质功能的一组长度>200个核苷酸的基因编码产物，其在多种肿瘤病情的发展中发挥重要功能；现发现其在不同物种中的自我保守性不稳定，但某些表达重要功能的LncRNA中，含有部分高保守元件，这些高保守元件可维持其功能的稳定表达，降低异变性，这可能是一个治疗骨肉瘤的靶点方向。而近年来发现LncRNA与miRNA存在海绵效应，即LncRNA作为miRNA的内源竞争性RNA(ceRNA)，可像海绵吸水一样将miRNA吸附到LncRNA的长链上进行调控作用，进而发挥促进或抑制骨肉瘤发展的功能。现就骨肉瘤中miRNA关联的长链非编码RNA的研究进展综述如下。

促进骨肉瘤增殖发展的LncRNA

最新的许多研究表明，较多LncRNA对骨肉瘤的病情发展有促进作用，将其沉默后可达到缓解病情的目的，而其中大部分都与miRNA有关。

ADPGK-AS1：Luo等研究发现ADPGK-AS1在骨肉瘤组织与细胞中被大量诱导表达，而miR-542-3p在同等环境下表达降低；功能实验表明，抑制ADPGK-AS1可以促进细胞凋亡。同时miR-542-3p被证实是ADPGK-AS1的靶向miRNA，miR-542-3p表达上调可以逆转ADPGK-AS1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的正向作用。但其中详细分子机制尚待进一步研究。

LINC00963：Zhou等经研究发现LINC00963在骨肉瘤细胞中高表达。荧光素酶报告基因实验显示，LINC00963可以通过靶向结合miR-204-3p来抑制其表达；此外，研究初步证明了FN1(纤维连接蛋白1，Fibronectin-1)是LINC00963/miR-204-3p轴在骨肉瘤中的靶点，FN1是纤维连接蛋白家族的一个成员，近年来的研究已证明其与多种癌症的侵袭迁移有关，但其在骨肉瘤中详细作用机制尚不明朗，综上所述，LINC00963可通过负向调控miR-204-3p，并促进FN1的表达来增强骨肉瘤细胞的增殖和迁移。

SND1-IT1：SND1-IT1在近期研究中被发现在骨肉瘤中过表达。实验发现miRNA-665是SND1-IT1的靶基因，两者呈负相关，而POU2F1(第2类POU结构域转录因子1)是miRNA-665的靶基因，其过表达可导致DNA异常表达，并且可以促细胞上皮转化EMT，实验发现，miRNA-665可使POU2F1表达水平降低，而SND1-IT1可促进其表达。由此可初步推测，SND1-IT1可通过抑制miRNA-665表达从而上调POU2F1，加强骨肉瘤的增殖和迁移能力，最终促进骨肉瘤的进展。

TMPO-AS1：TMPO-AS1在近期研究中被发现在骨肉瘤组织和细胞中显著过表达。研究表明，TMPO-AS1可以靶向结合于miR-199a-5p，且miR-199a-5p的过表达可抑制骨肉瘤发展。此外，WNT7B(Wnt蛋白家族7B抗体)是Wnt/β-catenin通路的关键成分之一，其被证实是miR-199a-5p的下游基因，过表达可促进组织上皮化，提高细胞异型性。挽救实验表明，在抑制miR-199-5p表达的骨肉瘤组织中再度抑制WNT7B，细胞增殖程度下降，这证明了WNT7B的表达被miR-199a-5p反向调控。由此可推测TMPO-AS1通过负向作用于miR-199a-5p，增强了WNT7B表达，从而促进骨肉瘤的发展，这为临床治疗提供了全新的治疗方向。Liu等发现TMPO-AS1与miR-329呈负相关，miR-329与E2F1呈负相关；E2F1是一个关键的细胞内转录因子，是E2F家族中第一个克隆的蛋白，其与EMT高度相关，因此TMPO-AS1可通过负调控miR-329来促进E2F1表达，进而促进EMT的发展，最终导致骨肉瘤发生发展。

RP11-361F15.2：RP11-361F15.2经最新研究发现在骨肉瘤组织中显著升高。研究发现miR-30c-5p可负向作用于CPEB4(胞质聚腺苷酸结合蛋白4)，而RP11-361F15.2可通过竞争性地结合miR-30c-5p来上调CPEB4的表达，而CPEB4在多种人类肿瘤中均有异常表达，且在癌症患者中的异常表达与预后有显著相关性。而在骨肉瘤中，RP11-361F15.2可通过抑制miR-30c-5p使CPEB4的表达上调，从而促使骨肉瘤细胞迁移侵袭，另外RP11-361F15.2还可以诱导TAMs极化，研究已证实肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的极化被认为在肿瘤迁移和侵袭中起关键作用；但关于RP11-361F15.2相关的TAMs极化方面的详细分子机制尚不明确，应进一步深入研究。

PCAT6：Zhu等研究发现骨肉瘤组织中PCAT6表达升高，并且PCAT6的表达上调与骨肉瘤细胞的转移状态和晚期预后呈正相关。此外PCAT6可作为ceRNA负向调控miR-185-5p，从而增强miR-185-5p的靶向标志物TGFBR1和TGFBR2的表达，进而激活TGF-β通路，而TGF-β在较多肿瘤中都被证明可促进癌细胞增殖侵袭。总之，PCAT6通过抑制miR-185-5p促进TGF-β通路表达，从而促进骨肉瘤的发展。有学者发现将PCAT6过表达后，MDM2E3(泛素蛋白连接酶)表达增加，P53和P21水平降低，骨肉瘤的细胞学功能得到促进，下调MDM2后，骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。此外，当MDM2下调后，P53和P21的表达得到了部分恢复。这些结果表明，PCAT6通过促进MDM2的表达，抑制P53和P21的表达，从而促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

CDKN2B-AS1：CDKN2B-AS1经近期研究表明在骨肉瘤组织中过表达，研究发现CDKN2B-AS1可靶向作用于miR-4458，而MAP3K3经分子机制实验被证实是骨肉瘤中miR-4458的下游靶点，并被miR-4458负调控；在CDKN2B-AS1抑制后的骨肉瘤组织中，MAP3K3的强制过表达可以部分挽救被抑制的细胞增殖状态。因此，CDKN2B-AS1通过负调控miR-4458增强MAP3K3的表达，从而促进了骨肉瘤的进展，但关于MAP3K3的详细功能，应进一步研究。Abula等发现CDKN2B-AS1可抑制microRNA-122-5p(miR-122-5p)，使细胞周期蛋白G1(CCNG1)表达升高，进而促进骨肉瘤细胞的增殖。

DDX11-AS1：DDX11-AS1在Zhang等的研究下发现其在骨肉瘤细胞中显著过表达。功能缺失实验发现DDX11-AS1表达水平降低后，骨肉瘤细胞增殖、转移及上皮-间质转化(EMT)过程遭受抑制；实验证明DDX11-AS1可以通过抑制miR-873-5p来上调骨肉瘤组织中DDX11的表达，而DDX11已证明与多种肿瘤组织的病情进展有关，同时功能试验证明了miR-873-5p表达上调可以在骨肉瘤中的细胞增殖、转移和EMT过程发挥抑制性作用。此外，DDX11-AS1在骨肉瘤中通过与IGF2BP2(人胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2)结合来提高DDX11稳定性，而IGF2BP2已被证明参与维持多种LncRNA的稳定，可间接促进肿瘤细胞的生长。综上所述，DDX11-AS1通过抑制miR-873-5p上调骨肉瘤组织中DDX11，并可通过与IGF2BP2结合稳定并促使DDX11发挥功能，从而促进骨肉瘤进展。

DANCR：Pan等研究发现DANCR在骨肉瘤组织和细胞系中过表达。功能实验表明DANCR的表达下调可诱导细胞凋亡。DANCR是miR-216a-5p的ceRNA，而SOX5是miR-216a-5p的直接靶点，过表达的miR-216a-5p通过下调SOX5的表达起到抑制细胞增殖的作用。SOX基因家族是一类Y染色体性别决定区(SRY)相关基因构成的基因家族，SOX5是其家族中一员，与多种肿瘤发展呈正相关。总之DANCR可通过抑制miR-216a-5p上调SOX5的表达，从而促进骨肉瘤组织增殖侵袭。Wang等发现下调DANCR可抑制ROCK1介导的骨肉瘤细胞增殖和转移，并通过负作用于miR-335-5p和miR-1972，促进ROCK1介导的侵袭转移；ROCK1(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶)高表达可提升肌球蛋白轻链磷酸化水平，增加肌动蛋白和肌球蛋白的收缩力，提升细胞的侵袭能力。

FTX：Huang等发现FTX通过调控TXNRD1/miR-320a轴发挥其对骨肉瘤的调控作用，Huang等经QRT-PCR实验发现，骨肉瘤中FTX和TXNRD1表达水平异常上调，而miR-320a表达明显下降；荧光素酶报告基因分析显示，FTX和TXNRD1均可与miR-320a结合，并可同时抑制其表达，但内在详细的分子机制尚不明确，待进一步深入研究发现。Chen等发现FTX在骨肉瘤组织和细胞系中的表达水平升高，与miR-214-5p的表达水平呈负相关。沉默FTX后骨肉瘤的生长和转移受到抑制，此过程中miR-214-5p表达上升。此外，FTX还可以通过作用调控miR-214-5p进而调节SOX4的表达；SOX4是SRY-BOX转录因子家族中的一员，已发现其在多种癌症中过表达。综上，FTX可负调控miR-214-5p，进而上调SOX4表达，从而导致骨肉瘤发生发展。

KCNQ1OT1：Wang等经实验发现KCNQ1OT1在骨肉瘤中的表达上调，分子机制实验表明，KCNQ1OT1可作为miR-4458的ceRNA抑制miR-4458的功能，并增强了KCNQ1OT1靶基因CCND2(cyclinD-2)的表达，而CCND2与多种肿瘤细胞增殖有关。总而言之，KCNQ1OT1抑制其ceRNA-miR-4458的表达，从而使得自我表达增强，同时上调其靶基因CCND2的表达，最终使骨肉瘤细胞及组织增殖侵袭能力增强。Huang等发现下调KCNQ1OT1可抑制骨肉瘤中的Wnt/β-catenin信号通路。KCNQ1OT1可以负调控miR-3666，Kruppel样因子7(KLF7)是miR-3666的靶基因，当miR-3666被下调后，KLF7表达上升，Huang等发现，KLF7过表达后，已抑制的KCNQ1OT1-Wnt/β-catenin信号传导得到恢复。总的来说，KCNQ1OT1通过靶向作用miR-3666/KLF7轴促进骨肉瘤进展并激活Wnt/β-catenin信号传导。

MIR17HG：MIR17HG经最新研究发现其在骨肉瘤中过表达，并能提升细胞的顺铂耐药性。分子机制实验发现MIR17HG可靶向作用于miR-130a-3p和转录因子SP1，并且可以抑制miR-130a-3p表达，促进SP1表达；SP1已被证明与多种癌症病情发展相关。此外，SP1还可以与MIR17HG启动子区再次结合，进一步促进其表达，形成反馈环。这种自有反馈环的分子系统是一个全新的发现，是很有价值的研究方向，有必要继续深入研究。

PBB12：PBB12经近期研究发现在骨肉瘤中表达增加。分子机制研究发现，PBB12可与hsa-miR-204-5p竞争性结合，同时PBB12可干预kruppel样因子4(KLF4)来激活转录因子2(ATF2)通路，进而增强骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。PBB12高表达可导致抑癌基因KLF4和hsa-miR-204-5p功能丧失。此外，功能实验数据显示，PBB12沉默后，KLF4对肿瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用被显著增强。总之，PBB12通过抑制hsa-miR-204-5p表达，促进自我表达上升并激活ATF2通路，抑制KLF4的表达，从而促进骨肉瘤发展。

MYOSLID：MYOSLID在最新研究中发现在骨肉瘤组织中高度表达，MYOSLID被敲除后可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；通过荧光素酶报告基因实验和RNA下拉实验，证实了MYOSLID与miR-1286可直接相互作用，由此推测miR-1286是MYOSLID的靶标基因。MYOSLID被抑制后，可促进miR-1286在骨肉瘤细胞中的表达，这说明MYOSLID的表达与miR-1286的表达呈负相关。另外用生物信息学方法以及荧光素酶报告基因实验，证实了miR-1286的靶向基因是RAB13。而RAB13是多种癌症的典型致癌基因。因此可认为，MYOSLID可通过抑制miR-1286的表达上调RAB13，从而加快骨肉瘤的进程。

综上所述，LncRNA作为miRNA的ceRNA(内源竞争性RNA)，可充分发挥其海绵功能，可吸附相关miRNA进行单向正表达水平的调控，进而通过相关信号通路或因子促进骨肉瘤的发展变化，现已确定LncRNA单向调控miRNA，但miRNA是否能反作用于LncRNA，是否可以通过相关通路或细胞因子进行负反馈作用，现在尚不得知，若miRNA可靶向负反馈调节LncRNA，对于临床治疗将有很大意义，这些问题仍须继续深入研究。

抑制骨肉瘤增殖发展的LncRNA

在骨肉瘤中，除了大多数起到促进作用的LncRNA，另有一些LncRNA的表达可抑制骨肉瘤的发展，起到负向作用，现将与miRNA相关的该类基因的作用机制列举如下：

LINC-PINT：该基因近期研究被发现在多种癌性组织中均有抑制性表达；Liu经研究发现LINC-PINT在骨肉瘤组织中表达减低，而在其表达增强的组织中发现miRNA-21表达下降，由此可见LINC-PINT过表达可抑制miRNA-21表达，实验已证明miRNA-21过表达会提高细胞的增殖侵袭性，但miRNA-21过表达却对LINC-PINT表达无明显影响，这说明LINC-PINT对其发挥单向作用的功能。总之，LINC-PINT可能通过下调miRNA-21抑制骨肉瘤发展，而详细的分子机制应进一步深入研究。

MEG3：近年研究证明MEG3在骨肉瘤组织中异常表达，有明显的抑癌功能，而既往研究表明MEG3可与p53结合，发挥协同正向作用抑制肿瘤发展。而最新研究发现MEG3和miR-361-5p在骨肉瘤组织和细胞系中同比显著下调，实验发现MEG3可直接靶向结合miR-361-5p，显著上调其表达，上调的MEG3和miR-361-5p明显抑制骨肉瘤细胞生长转移，但其中具体的分子机制尚不明朗，尚需进一步查明。

SERTAD：SERTAD基因，被认为是关键的核转录参与者，在细胞增殖及异变性上发挥着重要的调控作用。近期研究发现其与骨肉瘤的发展有关；实验中发现SERTAD2-3在骨肉瘤细胞中过表达，并可通过诱导细胞G1期周期阻滞和细胞凋亡来抑制细胞生长；而miR-29c经研究发现其是SERTAD2-3的ceRNA，且两者的表达呈负相关。实验发现miR-29c在骨肉瘤组织中表达上调，并可靶向抑制于抑癌基因PTEN，提高骨肉瘤细胞的增殖侵袭性，因此初步推测，SERTAD通过抑制miR-29c的表达，促进PTEN表达，进而抑制骨肉瘤的发展。

综上所述，LncRNA作为miRNA的ceRNA，可充分发挥其海绵功能，可吸附相关miRNA进行单向负表达水平的调控，从而抑制骨肉瘤的发生发展，但有两个问题：(1)抑制性miRNA相关LncRNA较促进性LncRNA数量要少，这是否和miRNA的某些作用有关；(2)抑制性miRNA相关的信号通路和因子未得到深入研究，这是否说明在抑制骨肉瘤的过程中，某些信号通路和细胞因子的功能发挥的较为隐匿或者是消极作用，这些都须进一步研究。

LncRNA及miRNA共同作用下的骨肉瘤预后情况

骨肉瘤作为一种预后极差的骨科疾病相关肿瘤，远期的生存率尤为重要，现对于骨肉瘤基因层面的研究仍不完善，探索到抑制骨肉瘤相关LncRNA较少，而抑制性LncRNA的意义对于骨肉瘤的治疗有着极其重要的作用，但对于强化抑制性LncRNA表达后会不会减弱增强性LncRNA的作用，还须进一步研究证明。而miRNA大多数可作为内源性竞争性RNA调控LncRNA的表达进程，这也是能够改善预后的治疗方向。总之现今骨肉瘤的预后年限虽然上升，但总体不容乐观，仍须继续研究延长患者预后时间。

展望

目前，对于参与骨肉瘤病情发展的LncRNA的研究日渐广泛及深入，少部分被发现存在抑制性表达，如SERTAD、LINC-PINT和MEG3等可起到抑癌作用，而大多数LncRNA都倾向过表达，如ADPGK-AS1、LINC00963、CDKN2B-AS1和MIR17HG等都增强了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移性，现是否可将某些高度表达的LncRNA作为生物标志物来预测骨肉瘤患者的预后，认为是一个较新的研究领域，这可为治疗方案的制订提供更好的方向，应充分进行发掘研究。此外，还有很多与骨肉瘤相关的LncRNA未被发现，即使发现了的LncRNA依然尚有很多分子机制不明确，尤其是关于作为内源性竞争性RNA的miRNA的具体调控机制，还须继续研究，所以还需要继续不断的发展分子生物学技术，以求未来对骨肉瘤的治疗提供更多的指导方向，但可以明确的是，LncRNA及miRNA在骨肉瘤方面的角色十分重要。

来源：中国骨与关节杂志2022年1月第11卷第1期

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