作者：崔静静，王莉，首都医科大学附属北京妇产医院超声科

迄今为止，染色体异常尚无有效的治疗手段，因此在孕早期通过筛查和产前诊断的方法及早识别染色体异常，对降低缺陷儿出生率、提高出生人口的健康素质、减轻孕妇的身心伤害、减轻家庭及社会的经济负担尤为重要。

在二孩政策放开以后，高龄孕妇的比例急剧增加，随着孕妇年龄的增长，胎儿患染色体病的概率也随之增加，以唐氏综合征为例，20、35、45岁产妇的胎儿患病概率分别为1/1667、1/378、1/30。此外，还有许多孕妇采用体外受精-胚胎移植方式受孕，也有的孕妇有多次流产史等，胎儿对他们来说格外珍贵，因此寻求一种安全有效的染色体筛查方法意义重大。无创产前DNA检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）作为一种新兴的无创基因检测手段，是当今医学领域研究的热点，在临床中的应用越来越广泛。目前产前超声是临床最常用的产前无创影像学检查技术，本文主要介绍了超声联合NIPT在临床运用中的新进展。

1.超声筛查

目前，超声检查作为一种无创的产前筛查、诊断手段，被广泛用于临床。现在越来越多的学者强调产前筛查的核心要放在孕早期，孕早期通过超声筛查主要可发现严重结构异常及超声软指标。超声软指标指在超声检查时发现的胎儿解剖结构非特异性微小变化，因此又称微小异常，多属于正常变异。遗传超声学研究显示胎儿超声微小异常与胎儿染色体异常风险增高有关。

目前，孕早期常用的提示染色体异常高风险的超声软指标通常包括：①颈项透明层增厚（nuchal translucency，NT）。孕11～14周≥3mm为增厚（一般要求头臀径在45～85mm时测量），但Christiansen等研究了NT值在不同异常染色体中的分布发现，21、18、13-三体的胎儿NT中位数分别为2.8、3.0和3.4mm，且与正常胎儿相比差异有显著性，故NT值（2.5～3.0mm）也与染色体非整倍体异常相关。②鼻骨未显影或鼻骨发育不良。孕11～13+6周有明显的鼻骨缺失或3个解剖平面均未能显现鼻骨特征。③脉络丛囊肿。一侧脉络膜内圆形或椭圆形的囊性结构呈无回声区，可以单发或多发，约在孕26周消退，若不消退则可能存在胎儿染色体异常。④单脐动脉。在脐带内及膀胱旁均仅显示一条脐动脉。⑤三尖瓣反流。⑥静脉导管a波反向。⑦额上颌角增大或发育不良。⑧脐膨出。⑨外耳长度短。外耳长度测量方法为于外耳旁矢状切面时从外耳耳轮顶点至耳垂间拉取直线，测量直线长度，共测量3次，结果取平均值。超声测得胎耳长/预计胎耳长＝0.8为正常与异常的分界线。外耳畸形包括耳前赘生物、低位耳和耳缺。

罗欢等认为二维、三维超声应用于胎儿外耳形态的检测具有较好的外耳结构呈现效果，有助于对外耳形态的准确判断。胎儿外耳畸形筛查在孕12～14周即可开展，该阶段外耳郭形成且位置基本固定，超声下外耳获得率高，更有助于早期发现异常。孕早期超声筛查的严重结构畸形包括无脑畸形、脑膜膨出、淋巴管囊肿、单脐动脉、部分肢体畸形、开放性脊柱裂、心脏结构异常（心内膜垫缺损、单心室、右室双出口、肺动脉瓣缺如）、先天性骨发育不良、巨膀胱、腹壁裂、腹腔囊肿、消化道畸形、脐膨出和全前脑。

有研究指出，具有2、3项及以上超声异常征象的胎儿其染色体异常的发生率更高。利用NT增厚筛查21-三体的灵敏度为80%，假阳性率为5%。单纯利用静脉导管a波异常筛查非整倍体染色体异常的效能较低，但联合利用NT和静脉导管a波异常筛查染色体非整倍体异常的灵敏度可达93.5%[5]。当孕早期超声筛查出现以上异常征象时，应及时建议孕妇进一步做基因检测。NIPT适用于孕早、中期，而羊水穿刺在孕中期进行。

孕早期超声联合NIPT检测提高了染色体异常的检出率，能够尽早筛查出结构畸形及染色体异常，以便临床及早干预，合理利用医疗资源，减轻孕妇家庭及社会的经济负担，而且也能够在孕妇与胎儿尚未建立亲密感情之前实施引产，减轻引产对孕妇的身心伤害。

2.NIPT技术

2.1　NIPT技术与有创基因检测技术的比较　

按照取材部位不同，介入性产前诊断可分为羊水穿刺、绒毛穿刺和脐带血穿刺，是产前诊断的“金标准”，但是容易引发胎膜早破、绒毛羊膜炎、阴道出血、早产，有0.5%～1%的流产风险，给孕妇的身心健康带来了很大的伤害，也造成了一定的经济损失，因此该技术难以被广泛接受。近年来，NIPT以无创、安全等优点得到了广泛的临床应用，与有创检查相比，孕妇更倾向于选择无创检查。该技术主要通过采集孕妇外周血并提取胎儿游离DNA或循环胎儿细胞进行基因检测，对胎儿本身没有伤害，适用于孕10～26周的所有孕妇（适用范围广），无需进行细胞培养，获取结果迅速。目前主要将胎儿游离DNA、胎儿滋养层细胞、胎儿有核红细胞及胎儿游离RNA等作为新兴的研究物质，通过基因检测来确定有无染色体异常。

2.2　胎儿游离DNA、胎儿滋养层细胞DNA、胎儿有核红细胞的检测作用比较　

胎儿游离DNA与母亲DNA混合，易被破坏，在孕妇外周血中浓度低，识别并提取孕妇外周血中的胎儿DNA需要高精确度和高准确性的检测工具。母血中的滋养层细胞DNA属于完整的胎儿细胞，保存完好，没有与母体DNA直接混合，纯度高，细胞表面有特异性标志物，分离细胞相对容易，不易受母体DNA干扰，使检测能够以更高的分辨率进行。

胎儿有核红细胞是最理想的产前检测来源细胞，其优势包括：①为单核细胞，分化好，形态上易辨别，含有胎儿完整的遗传信息；②存活周期约90d，在母体血循环中不会持续至下次妊娠，因此，作为产前检测细胞来源不受上次妊娠的影响；③细胞表面具有特异性的标志物，可作为细胞分选的依据。在孕早、中、晚期孕妇外周血中均可发现胎儿有核红细胞，最早在孕8周时存在并且在孕早、中期随着孕周增加而增多，在孕18周时孕妇外周血中HbF+CD71+细胞数量达到峰值，之后随孕周增加而呈下降趋势。利用孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行无创性产前诊断的最佳时机应在孕16～20周。

2.3　提取胎儿细胞的方法　

一般采集血液样本，通过消耗母体细胞或利用胎儿细胞表面抗原或特异性标志物来富集胎儿细胞，使胎儿细胞比例增高，再用毛细管采集这些细胞并进行全基因组扩增，最后选定一种测序方法检测胎儿染色体。Vestergaard等在研究中指出，平均每30ml母血可分离12.8个胎儿细胞，目前一般选取2～7个细胞进行分析，未来有望通过1～3个细胞即可分析得出结果。

随着材料科学的发展，纳米材料与传统技术相融合，在各项研究中的应用日益增多。高海侠等以纳米材料为基底，选用抗体CD147修饰到以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上，对新生儿脐血中的胎儿有核红细胞进行捕获，利用胎儿特异性抗体HbF、红细胞表面特异性抗体CD71以及细胞核染色剂DAPI对捕获到的新生儿脐血中的有核红细胞进行染色标记，进而实现分选，可提高胎儿有核红细胞的检出率，为进一步的产前诊断奠定了基础。

武汉大学He等用类似的方法提取胎儿有核红细胞，平均每毫升孕妇外周血可捕获25个。该技术是诊断染色体非整倍体的最佳选择，原理简明，操作简单，结果简单易懂，但是应用一种探针只能检测一个已知的染色体异常，不能一次性地分析所有染色体，对于其他复杂的染色体结构异常如染色体易位、倒位、重复等畸形，该技术则无法完全替代传统的核型分析。

2.4　新的NIPT基因检测技术　

临床应用最广泛的基因检测技术包括染色体核型分析技术和FISH技术等。随着社会的不断发展，临床上对基因检测技术提出了更高的要求，而高通量测序（next-generation sequencing technology，NGS）、染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）技术的出现为NIPT带来了新的契机。NGS具有分辨率、敏感性和准确性高，方法灵活等优点，通过对全基因组的覆盖性检测，可发现拷贝数变异（copy number variation，CNV），以及染色体片段的微缺失和微重复，从而得到更为准确的基因变化信息。

通过对测序深度的改变，最小可以检测到10kb的CNV变化。常规染色体核型分析时如果被母体细胞污染会影响检测结果，而NGS可以通过采集母体血液验证结果，无需进行细胞培养，从而排除母体细胞污染的影响，对检测标本要求低，对污染、蜕化的绒毛也可进行检测，但并不能发现染色体平衡易位，并且费用较高，目前仅用于染色体非整倍体的快速检测。

CMA检测样本量需求小，仅需要提取很少量的细胞或组织，且该方法既可用于新鲜标本也可用于陈旧或冻存标本的诊断，因而用于诊断自然流产尤为适宜。该技术通过一次性杂交即可完成全基因组分析，根据需要可以检测出小于1kb的染色体微缺失和微重复，检测周期仅需2～3d。其操作过程可以由计算机自动控制，结果获取快速直接，实现了自动化。但是CMA不能检测出多倍体及其他染色体平衡结构重排，如异位、倒位和低水平的嵌合体。

CMA分为基于微阵列的比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization，array-CGH）和单核苷酸多肽性微阵列分析（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）两种。Array-CGH采用与待测样本相同性别的健康人群DNA或不同性别的健康人群混合DNA作为对照组，利用荧光素分别标记参照DNA和待测DNA，然后与探针进行杂交，获得定量的拷贝数检测结果，该方法分辨率为300kb。

Array-CGH技术使用的探针较长，优势在于用户可根据需要设计并制作芯片，可针对特定区域设计高密度探针，以增加在该区域的检测灵敏度和特异性。而SNP-array只需将待测样本DNA与一整套正常基因组对照资料进行对比，比较计算后即可获得诊断结果，通过高密度的探针增加了检测的分辨率。另外SNP-array上的探针除了带有拷贝数信息外，还带有SNP分型的信息，可用于检测杂合子缺失，而临床上利用杂合子缺失的信息可以对部分隐性遗传病及印记基因疾病进行诊断。

2.5　基因检测技术的临床应用

2.5.1　常见染色体异常的诊断　

目前NIPT能筛查出染色体21、18、13，已成功应用于临床。郭芳芳等发现，NIPT对常染色体非整倍体（13、18、21）的复合检出率和复合阳性预测值（100%，82%）均优于血清学筛查（60%～90%，0.5%～2%）。有研究指出，NIPT技术不仅可以筛查出染色体非整倍体异常，还能检测出嵌合体、不平衡异位和染色体片段的微缺失微重复。在Vestergaard等的研究中，于孕12+1～12+5周采集孕妇血样标本，利用胎儿细胞特异性抗体富集染色胎儿滋养细胞并进行基因组扩增，最后用array-CGH测序。基于滋养细胞的NIPT在孕早期即可诊断小CNV和点突变。

同时，Vossaert等通过提取胎儿滋养层细胞并进行NGS检测，发现5例有微缺失或微重复的患者，片段大小为153kb～18.9Mb，≥1Mb的异常拷贝数可以被检测出来，与侵入性诊断相应微阵列核型数据结果一致。该研究还指出，基于胎儿游离DNA的NIPT可能受母体胎盘嵌合体的影响而产生假阳性。

2.5.2　目前NIPT技术面临的难点　

NGS与微阵列分析技术最大的困难在于CNV的正确解读。目前国内对于临床意义不明确的CNV的检出率明显高于国外，可能因为经过父母验证的病例数少，适合中国人群的数据库不够完善，检测平台差异以及对数据的判读标准不同。NIPT技术仅作为一种筛查手段，其检查结果为高风险不能作为终止妊娠的指征，必须进一步进行产前诊断；对NIPT低风险人群必须进行常规产检和Ⅲ级彩色多普勒超声以排除胎儿发育异常，尽量避免异常胎儿的漏诊。

综上所述，孕早期超声检查联合NIPT检测能提高染色体异常的检出率，及时筛查出严重危害胎儿健康生长的结构畸形及染色体异常，以便临床及早干预，及时终止妊娠，同时作为无创性筛查尽可能地减轻了对孕妇及胎儿的身心伤害。为了全面建立NIPT的临床应用，需要扩大样本量，完善国内的数据库，正确解读临床意义不明确的CNV，为遗传咨询提供充足的依据同时应加强。有创检查的适应证还需进一步临床规范，高龄并不是选择羊水穿刺唯一的适应证。

来源：崔静静,王莉.超声联合无创产前DNA检测在孕早期胎儿染色体异常筛查中的研究进展[J].中国医刊,2019(06):611-613.

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