作者：高晓磊，梁新华，汤亚玲，四川大学华西口腔医院
肿瘤患者术后数年或数十年的复发是导致肿瘤相关性死亡的最主要原因。而在
1934年Willis首次提出肿瘤休眠的概念，随后Hadfield对其进行了补充，认为肿瘤休眠是一种短暂的有丝分裂及生长的停滞。前者事实上是真正意义上的休眠，也称为细胞性休眠，即某些肿瘤细胞的生长停滞于G0/G1/S期。而后者通常被认为是肿瘤细胞团块的休眠，肿瘤组织块中的细胞群体达到一个分裂与增殖的平衡状态而导致肿瘤组织的生长停滞。并且有文献报道肿瘤细胞团的休眠是通过血管生成休眠或（和）免疫性休眠机制所调控的。
众所周知，残留的肿瘤细胞在致癌过程中会不断地遭遇复杂的微环境，如缺氧、营养匮乏及化疗药物的刺激。而肿瘤细胞通过与周围微环境的相互对话，分泌及调控自身及宿主细胞的生长代谢等生命活动，通过进入休眠期或生长停滞期，降低生存条件以长期生存下去，并且可以逃逸宿主的免疫监视及逃避化疗药物的杀伤作用，而在适当时机通过某些机制再次进入增殖期，并最终形成微转移灶。
近20年来，作为微小残留病的主要来源，播散肿瘤细胞（disseminated tumor cell，DTC）的表型、特征、其周围微环境以及调控生存与休眠相关的信号通路等在大量文献中有所报道。DTC通常播散至肿瘤患者的骨髓当中，并且研究证实这些细胞大部分处于一种可复性的沉默状态。同时也有部分肿瘤细胞转移至外周血中，也称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。这类细胞可在周围微环境作用下获得干细胞样特征，而获得干性的一类CTC定义为肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）。
休眠的DTC很有可能与肿瘤休眠存在密切关系，并且有文献认为这类细胞可能是最终微转移灶的主要来源。然而DTC是如何在骨髓中生存及再激活形成微转移灶尚不明确，最近研究逐渐揭示DTC在肿瘤休眠中的可能机制。本文主要讨论了肿瘤细胞与微环境在转移进展中互动性地调控休眠的DTC的可能机制。解释无症状患者复发及远处转移的同时，肿瘤休眠机制还可能为阐述头颈部肿瘤患者高淋巴结转移率、低骨髓转移率的现象提供一定思路。更为重要的是，探索可能调控肿瘤休眠的分子机制，为将来新辅助治疗，甚至是精准医学带来了新的希望。
1. 肿瘤休眠的临床证据
关于肿瘤切除后的癌症患者再次复发的报道最早可追溯于古罗马时期（公元前25年—公元50年），Celsus医生当时注意到多种癌症患者经过手术治疗后，即使术区愈合良好，但仍出现了复发甚至死亡的情况。当时肿瘤休眠的概念尚未形成，未受到广泛关注。直到20世纪初，麻醉的迅速发展以及更先进的手术技术，为肿瘤的根治及术后肿瘤复发的研究提供了巨大的帮助。
1934年，澳大利亚病理学家Willis在对肿瘤复发患者进行尸检后，指出切除原发肿瘤后并未发生局部复发的患者仍可出现远处转移，因此Willis提出“癌细胞”在生长停滞的组织中一定处于一种休眠的状态。1954年，英国病理学家Hadfield进一步提出，术后5年出现继发肿瘤可能是由于肿瘤细胞处于一种“有丝分裂短暂性停滞”状态。过去几十年中，有文献报道部分患者术后很长时间后复发。如尽管
如1997年的一篇报道中记录，初始诊断单发性原发性
2. 休眠相关性肿瘤细胞
2.1 DTC
自从20世纪80年代至今已经在多种肿瘤患者的骨髓中检测到DTC。最近研究结果发现，某些DTC可长时间维持在一种休眠状态，这类细胞缺少增殖（Ki-67，增殖细胞核抗原）及凋亡（TUNEL assay，M30）标记物的表达，同时这类细胞还被证实对传统的放化疗耐受。越来越多的证据显示骨髓是上皮源性肿瘤DTC归巢的最常见器官，如乳腺癌、
目前，在临床上一般通过骨髓穿刺获得DTC，但由于该方法对患者的损伤性较大，临床应用因此而受到限制。骨髓中检测DTC主要有两种方法：免疫学试验及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）相关分子试验。前者主要通过利用肿瘤细胞中蛋白质的单克隆抗体抗原反应，如绿色荧光蛋白反应试验。后者主要检测组织特异性转录因子。
2.2 CTC
最近，外周血中检测CTC正在成为提示肿瘤患者远处转移及预后较差的指标之一，并且建议该项指标可以应用于乳腺癌、前列腺癌、
CTC的检测及富集目前主要基于其上皮细胞黏附因子以及细胞角蛋白（epithelial cell adhesion molecule；cytokeratin，EpCAM/CK）的表达差异。比如，AccuCyte-CyteFinder系统是一种依赖于细胞密度进行分离的装置，同时配有数字化扫描显微装置，该系统已经应用于临床无损监控肿瘤患者组织样本中CTC含量，同时还可高精确度地分离基因组学异常的单个肿瘤细胞。然而考虑到外周血中CTC浓度太低，仍需要改善目前技术方法的灵敏度以提高临床应用价值。
2.3 CSC
研究证实，一些实体肿瘤中可检测到CSC，包括恶性黑色素瘤、头颈部恶性肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和
Chaffer等认为CSC是一类具有肿瘤始动潜力的细胞，但这类细胞可处于短暂的生长停滞阶段。目前认为，CSC的激活和休眠与其细胞自身的表观遗传再编辑密切相关。如部分miRNA可以参与调控多种肿瘤中CSC的自我更新及分化能力。在头颈部肿瘤的CSC中，miR-424、let-7α、miR-6836、Mir-6873均呈低表达，而miR-147b、miR-7152则过表达。有研究证实，miRNA-34α可阻止EMT、降低乙醛脱氢酶的活性，削弱HNSCCCSC的增殖和侵袭能力等。
最近一项研究发现，HNSCC中的应激触发隔代遗传重编程（stress-triggered atavistic reprogramming，STAR）可能是调控CSC产生的最重要因素，甚至有人认为HNSCC进展高度依赖于STAR。
3. 肿瘤细胞休眠的分子调控机制
肿瘤细胞休眠指某些残留肿瘤细胞缺乏增殖及凋亡标记物，处于一种可复性沉默状态，导致肿瘤组织停滞生长。本文重点讨论肿瘤细胞与其微环境的相互对话调控肿瘤细胞的生命行为的潜在机制。
3.1 内源性信号通路
3.1.1 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路
MAPK家族是一类调控细胞应激外源性刺激反应的重要蛋白酶，MAPK在肿瘤形成过程中的作用十分复杂。Aguirre-Ghiso等通过实验发现，HEp3细胞株中呈胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）MAPK/p38 MAPK低比例，其相继在乳腺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌及
综上所述，ERK/p38信号通路的平衡与肿瘤细胞的休眠密切相关，并且作为调控肿瘤细胞休眠的两种重要蛋白酶，ERK/p38比例变化可能是调控休眠细胞的潜在分子机制之一。有数据显示，癌症术后患者给予p38抑制剂后，其骨髓、肝脏及脾脏中DTC数量有所增加。MAPK家族的第三种主要成员—JUK通常与p38 MAPK通路作用相反，可诱导肿瘤细胞的增殖致癌能力。但越来越多的实验研究显示活化的JNK对乳腺癌细胞的生长停滞和休眠有所帮助。此外，c-Jun氨基端激酶1/促分裂原活化的蛋白激酶激酶4（c-Jun NH2-terminal kinase activating kinase 1/mitogen-activated proteinkinase kinase 4，JNKK1/MMK4）证实参与调控DTC的生命活动，并且可诱导肿瘤细胞进入短暂的生长停滞期。
3.1.2 磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K-AKT）通路
PI3K/AKT通路在调控细胞周期中的作用目前已基本清楚。Humtsoe等认为在营养缺乏的环境中，肿瘤细胞分泌因子形成调控PI3K-AKT通路的系统。PI3K-AKT通路的下调可导致细胞沉默及自噬现象，该结果在休眠的HNSCC中也得到了验证。研究证实抑制AKT活性可引发表皮生长因子（epidermal growth factorreceptor，EGFR）自我磷酸化过程，导致肿瘤细胞进入生长阻滞期。
3.2 外源性因子
3.2.1 转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族
过去20年，在EMT血管生成及肿瘤细胞休眠中均发现了TGF-β，但其中的作用机制仍然不清。最近，潜在转化生长因子-β结合蛋白2（latentTGF-β binding protein 2，LTBP-2）被证实可促进
有报道称，TGF-β1可能是血管生成的抑制因子，抑制肿瘤的生长，但也有研究表明TGF-β1过表达与肿瘤的侵袭性和复发有关。TGF-β3与TGF-β1具有同源性，最近被证实在头颈肿瘤中可通过诱导骨膜蛋白POSTN加速肿瘤细胞的生长、迁移，提高侵袭性。然而，TGF-β2可通过p38 MAPK依赖途径诱导HNSCC肿瘤细胞的一个休眠表型，同时TGF-β诱导肿瘤细胞休眠需要酪氨酸激酶受体。以上结果可认为TGF-β家族在肿瘤进展中作用复杂，可抑制肿瘤细胞的生长，然而在肿瘤晚期中可促进其进一步发展。
Wendt等证实TGF-β主要是通过调控E-cad表达水平来实现其多功能的能力。Denys等通过结肠癌模型证实肿瘤细胞在基底膜提取物（包含多种生长调节因子及其他成分）中可维持休眠状态，无增殖迹象。因此，鉴别肿瘤早晚期应用TGF-β作为靶点治疗，是否有利于肿瘤的治疗十分重要，同时探究其他可能与TGF-β共同作用于肿瘤进程的有效因子也同样重要。
3.2.2 骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）
BMP7是TGF-β家族成员的一支，主要由骨髓的基质细胞分泌。最近有研究认为BMP7在CSC可以通过激活p38 MAPK通路诱导肿瘤细胞进入可复性的沉默状态。研究指出BMP7可能会诱导一个低比例的ERK/p38通路，进而促使头颈肿瘤中的HEp3细胞呈现休眠状态。敲除BMP7受体BMPR2基因后，BMP7活性受到抑制，结果提示BMPR2表达与肿瘤复发及骨转移呈负相关。因此，在肿瘤细胞中极有可能存在一个BMPR2依赖性BMP7诱导的细胞休眠。
另外，BMP7还可能参与肿瘤转移抑制基因NDRG1的活化过程。而这一过程可能依赖p38通路，因为p38抑制剂SB203580可以通过BMP7明显阻止NDRG1的上调。Buijs等证明BMP7可拮抗Smad介导的TGF-β效应，提示BMP7可能会成为抑制肿瘤局部进展和骨转移形成的有效靶点。尽管如此，BMP7可能诱导MET，MET被证实在促进肿瘤细胞形成微转移灶中起到重要作用。因此BMP7可能加速肿瘤的晚期转移过程。Hjertner等发现BMP4也可以诱导
3.2.3 髓源性基质细胞微环境
1978年Schofield首次定义造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）微环境。HSC主要分布于骨髓中，HSC微环境被认为是DTC生存和形成的“沃土”。最近研究证明DTC在HSC微环境中可以将HSC作为目标并取而代之，同时建立一个转移前微环境。在某些肿瘤类型中证实血管来源因子可调节DTC的休眠表型。如血管细胞黏附蛋白1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）可通过结合破骨细胞表达的整合素α4β1从而提高肿瘤细胞的转移侵袭能力。
显然，HSC微环境不仅可以提高DTC在骨髓中的生存能力，还可能促进DTC再激活形成微转移灶。此外，骨髓及血管周微环境中有大量的反式维甲酸（all-trans tretinoin，atRA），具有调控HSC的自我更新能力。因此，部分文献报道atRA可能与骨髓中其他因子共同参与到调控肿瘤细胞休眠过程当中，如TGF-β2、BMP7等。经atRA治疗后，来源于头颈肿瘤的增殖性肿瘤细胞中NR2F1和TGFβ2均呈高表达，肿瘤细胞进入休眠状态。骨髓中的成骨细胞及破骨细胞也可分泌一些特定的因子来调控转移性休眠及再激活行为。最新的研究结果证实生长停滞特异因子6（growth arrest specific6，Gas6）可通过Mer/mTOR信号通路调控DTC与CSC之间的转化，即Gas6低表达环境中，肿瘤生长较迅速。
相反，POSTN、TGF-β1可加速肿瘤转移形成。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）位于脉管系统管腔表面，由于其特殊的解剖位置，当DTC进入骨髓后首先遇到该类细胞。DTC可以指导MSC释放外泌体诱导部分DTC进入休眠周期，这些外泌体中携带多种miRNA，如miR222/223、miR23b。另外，MSC之间的一种互噬也可以作为调控肿瘤细胞休眠的特殊机制。因此，在未来MSC可能成为骨髓中调控肿瘤细胞休眠的一种重要工具。
4. 缺氧与肿瘤休眠
实体肿瘤中常发生缺氧现象，这种现象往往代表一部分肿瘤患者预后差、肿瘤转移率高、肿瘤负荷较大，包括头颈部恶性肿瘤、
Msaki等发现患乳腺癌的免疫缺陷小鼠晚期DTC中HIF-1α呈高表达状态，提示HIF-1α有利于提高DTC致癌能力。低氧环境可诱导休眠性MCF-7细胞中内生性LOXL2表达升高，继而促进EMT，赋予肿瘤细胞干细胞样表型，最终逃离休眠，形成微转移灶。此外，缺氧可启动EMT依赖于HIF-1α通路赋予肿瘤细胞干性表型，同时诱导肿瘤细胞中自噬系统，最终可能促使HNSCC早期或放化疗后的肿瘤细胞进入短暂休眠。
骨髓中的缺氧环境可以下调乳腺癌休眠细胞LIFR∶STAT3∶SOCS3信号通路，下调肿瘤休眠细胞相关基因，诱导DTC自发逃离休眠期，在远处器官增殖。此外，缺氧促使uPAR表达升高，后通过调控ERK/p38通路引发肿瘤细胞播散、侵袭、EMT、逃离休眠等一系列行为。然而，也有学者认为，缺氧似乎可能通过诱导肿瘤细胞的休眠而抑制肿瘤侵袭和进展。如Ameri等指出，肿瘤移植瘤模型中肿瘤坏死周围组织中缺氧诱导基因家族成员1A（hypoxiainducible gene domain family member 1A，HIGD1A）可以独立于HIF，促使肿瘤细胞休眠进而提高其生存率。因此，缺氧是如何调控DTC休眠行为需要更多的研究所证实。
5. HNSCC中淋巴结转移与休眠
头颈部肿瘤患者常发生淋巴结转移，往往带来严重影响且明显降低患者的生存率（50%）。肿瘤诱导的淋巴管生成逐渐被认为参与促进肿瘤生长和转移形成过程，包括原位复发、淋巴结转移及远处转移。Beasley等在HNSCC中证实侵袭性强的肿瘤中淋巴管形成活跃，提示瘤内较高淋巴管系统密度与颈部淋巴结转移密切相关。肿瘤淋巴管生成同样也参与启动淋巴结转移的始动过程。目前大量证据表明肿瘤细胞可在乳腺癌及头颈部恶性肿瘤患者的骨髓中寄居且呈一种休眠状态。尽管这两种肿瘤生物学具有较大差异，但这些患者骨髓中微转移率（30%~40%）十分类似。
根据以上数据可以提出假设：HNSCC患者的淋巴结存在一些休眠的肿瘤细胞，且这些细胞可导致淋巴管生成、淋巴结转移，甚至远处转移的发生。此外，头颈部肿瘤中的隐匿淋巴结也可能由肿瘤细胞休眠所解释。肿瘤来源因子动员及募集骨髓来源细胞（bone marrow-derived cell，BMDC）迁徙到转移微环境，是临床上经过一段休眠期后发生瘤内淋巴管生成及淋巴结转移的可能机制之一。比如，VEGF-A不仅可以直接动员骨髓中的BMDC，同时可以通过诱导促炎因子（S100A8、S100A9等）及
这种肿瘤诱导的淋巴管生成可进一步诱导瘤内或瘤体周围，甚者是远处器官的引流淋巴系统的形成。但是这类肿瘤来源因子是否可以再激活HNSCC患者淋巴结中的休眠肿瘤细胞尚不清楚。淋巴结因其自身的解剖位置及生理特征，常常充斥着炎性环境。最近De Cock等对炎性微环境调控休眠DTC的可能机制进行了初步探索。他们指出Zeb-1依赖性信号通路可调控肿瘤细胞逃离休眠期，Zeb-1是一种EMT的重要调控因子，由此猜测其他炎性因子可能具有类似的促肿瘤细胞再激活的作用，该机制在头颈部肿瘤中可能具有重要作用。
最近有研究显示CSC通过直接分化成为淋巴内皮细胞，并产生多种淋巴管生成性因子，从而有利于肿瘤诱导的淋巴管生成过程。因此，探索引流淋巴结和转移灶中的肿瘤休眠机制可能提高头颈部肿瘤患者的预后及生存率。比如通过靶向这些肿瘤来源因子驱动淋巴结中的肿瘤细胞进入休眠期，或灭活播散的肿瘤细胞，可能成为一种有效的新辅助治疗。同时这种治疗方法也可作为精准医学的一部分发挥作用，甚至头颈部肿瘤治疗中预防性颈淋巴清扫的必要性也需要重新评估。
6. 展望
目前广泛认为休眠相关性肿瘤细胞是引发肿瘤转移或复发的主要来源，包括DTC、CTC、CSC。大量证据证实这种细胞绝大多数可暂时性甚至永久性处于沉默状态。值得注意的是，5-
本文讨论了调控肿瘤相关的内源性外源性分子机制，并总结了一些可能的治疗靶点；同时也涉及肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用。此外，还做出了HNSCC中淋巴结转移与肿瘤休眠相关的假设。肿瘤细胞休眠机制为肿瘤复发与转移提供新的思路，同时对指导肿瘤患者临床治疗方案具有重要意义，彻底消除休眠肿瘤细胞还是维持肿瘤细胞休眠状态从而长期带瘤生存？然而仅仅维持肿瘤休眠是不能达到完善的治疗效果，更需要探究抑制休眠肿瘤细胞生存的治疗方法。如EI Touny等提出，Src与MEK抑制剂联合使用可以预防乳腺癌患者的复发。综上所述，鉴别调控肿瘤细胞休眠的重要因子对未来探究新的靶向治疗提供新的依据，甚至肿瘤细胞的休眠可能成为肿瘤治疗中的“特洛伊木马”，最终攻陷肿瘤。
来源：王琪,周欣奕,丁一.炎性衰老在牙周炎中的作用[J].华西口腔医学杂志,2018,36(01):99-103.
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