作者：张胜伟，陆海涛，周青云，王海飞等，承德医学院附属医院皮肤科，承德医学院附属医院质量控制办公室， 河北，滦平县中医院皮肤科，承德医学院附属医院中心实验室， 河北医科大学第四医院皮肤科

尖锐湿疣（CA）又称尖湿疣、性病疣、肛门生殖器 疣和生殖器疣，是由人类乳头瘤病毒（HPV）感染所致 的生殖器及肛周增生性损害[1]。本病是皮肤性病科门诊常见病，具有传染性和致癌性，且严重影响患者的生 活质量。 胱天蛋白酶（caspase）家族分为炎症型和凋亡 型两大家族，其中凋亡型进一步分为 2 个亚类：启动 型（caspase-2、8、9、10）和执行型（caspase-3、6、7）[2]。而 caspase-8 和 caspase-3 分别在 caspase 级联反应的起 始者与执行者中处于核心地位[3]。 survivin 是近年研究 发现的最强的凋亡抑制因子，其与细胞增殖和血管生 成呈正相关[4]。 已有研究证实 CA 皮损中 caspase 表达 下调，而 survivin 表达上调[5-6]。但是 caspase 和 survivin与 CA 分型之间的关系尚未明确， 本研究对 CA 组织 HPV-DNA 低危型和高危型与凋亡相关蛋白的关系进 行探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集 2015 年 11 月—2016 年 3 月在承德医学院 附属医院皮肤性病科病理室及检验科聚合酶链式反应 （PCR）扩增室共同确诊的 60 例 CA 患者的蜡块。 入选 标准：HPV-DNA 分型检测阳性的 CA 患者；初发患者； 年龄 18～60 岁。 排除标准：已经接受过药物治疗者；并 发其他性病患者；并发其他增生性皮肤病患者；并发其 他肿瘤性疾病患者。 CA 组织病理诊断标准参见文献[7]：表皮呈乳头 瘤样增生，伴轻度角化亢进及角化不全；部分区域棘细 胞上层及颗粒层内可见空泡化细胞，细胞体积较大，有 一圆形深染的核，在核膜及浆膜间有丝状物相连，使细 胞呈猫眼状；真皮乳头增宽、上延，伴血管扩张。采用流 式荧光杂交法检测患者 HPV-DNA 分型， 并将其根据 分型结果分为 2 组。 高危型组 30 例，其中男 15 例，女 15 例，中位年龄 30.50 岁；分型情况：16 型 9 例，58 型 5 例，52 型 3 例，56、18 及 51 型各 2 例，53、66、35、59、 33、39 及 31 型各 1 例，其中并发感染 HPV-DNA 低危 型 7 例，同时感染 2 种 HPV-DNA 高危型 6 例，感染 1 种 HPV-DNA 高危型 17 例；皮损分布：男性分布于冠 状沟及肛周，女性为阴道口；皮损大小中位数 12（123） mm3。 低危型组 30 例，其中男 16 例，女 14 例，中位年 龄 28.50 岁； 分型情况：6 型 10 例，11 型 6 例，43 型 5 例，81 及 61 型各 3 例，42 型 2 例以及 55 型 1 例，30 例均为感染 1 种 HPV-DNA 低危型；皮损分布：男性分 布于阴茎，女性为大小阴唇之间；皮损大小中位数 80 （231） mm3。 选取 10 例四肢色素痣旁正常皮肤组织蜡 块作为正常对照组， 其中男 5 例， 女 5 例， 平均年龄 （30.00±7.12）岁。 3 组性别及年龄比较，差异均无统计 学意义（P 均>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 二甲苯脱蜡入水， 然后梯度酒精脱 水。3%过氧化氢室温孵育 10 min，PBS 冲洗 5 min×3次， 加入封闭液封闭 30~40 min，吸去多余的封闭液，滴加 一抗（一抗工作浓度 1∶50），湿盒中 37 ℃孵育 60 min， PBS 冲洗 5 min×3 次；滴加生物素标记的二抗，室温下 孵育 10 min，PBS 冲洗 5min×3 次；滴加链霉亲和素-过 氧化物酶溶液， 室温下孵育 10 min，PBS 冲洗 5 min×3 次，DAB 显色， 苏木精复染细胞核，1%盐酸乙醇分化， 氨水返蓝，双蒸水冲洗、晾干，中性树胶封片。用已知阳 性片作为阳性对照组，用 PBS 代替一抗作为阴性对照 组[8]。兔抗人 caspase-3、caspase-8 及 survivin 单克隆抗体均购自美国巴傲得生物科技有限公司，免疫组化 SP 法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 免疫组化结果判定 光镜下，采用双盲法对每张 切片随机选取 5 个高倍视野（×400 倍）进行拍照。 根据 综合染色强度和染色面积所占比例进行半定量测定。 染色强度评分标准：不着色为 0 分，黄色 1 分，棕黄色 2 分，黄褐色 3 分；染色面积所占比例评分标准：<10％者 0 分，10％~39％者 1 分，40％～69％者 2 分，>70％者 3 分。 二者评分相加，0～1 分为阴性（-），2 分为弱阳性（+），3～4 分为阳性（++），5～6 分为强阳性（+++）[9]。

1.3 统计学处理

应用 SPSS19.0 统计学软件分析数据，计数资料采 用行×列表 χ2 检验进行分析。 P<0.05 认为差异有统计 学意义。

2 结 果

2.1 3 组 caspase-3 表达水平比较

3 组 caspase-3 均有阳性表达， 其阳性定位于细 胞质，高危组和低危组中阳性细胞分布于棘层，正常 对照组中阳性细胞分布于表皮全层。 Caspase-3 在高 危组主要为+（图 1A），低危组多为+~++（图 1B），而在 正常对照组中的表达多为+++（图 1C）。 正常对照组中 阳性细胞最多，染色强，低危组次之，高危组阳性细胞 少，染色淡，低危组居于二者之间。 Caspase-3 在高危 组、 低危组及正常对照组中的阳性表达率分别是 13.33%、43.33%和 90.00%（表 1），3 组两两比较，差异 均有统计学意义（P 均<0.05） 。

2.2 3 组 caspase-8 表达水平比较

3 组 caspase-8 均有阳性表达，同样为胞质着色， 高危组和低危组阳性细胞分别位于颗粒层和棘层，正 常对照组阳性细胞也分布于表皮全层。 Caspase-8 在 高危组中为+~++（图 2A），以++最多，着色细胞少，染 色浅；低危组为+~+++（图 2B）；而在正常对照组中表 达基本为+++（图 2C）。 Caspase-8 在高危组、低危组及 正常对照组中阳性表达率分别是 16.67%、40.00%及 90.00%（表 1），各组差异均有统计学意义（P 均<0.05）。

2.3 survivin 在 3 组中表达水平比较

正常对照组中未检测到 survivin 的表达（图 3C）。 在高危组和低危组中 survivin 阳性表达定位于细胞 质，以棘层最多。 Survivin 在高危组中多为++~+++（图 3A）；在低危组中多表达为+~++（图 3B）；高危组阳性 细胞数目比低危组多，且染色更强，核膜与浆膜之间 可见丝状物，胞体较大。 Survivin 在高危组、低危组及 正常对照组中的阳性表达率分别为 76.67%、43.33% 及 0.00%（表 1）， 各组比较差异均有统计学意义（P 均<0.05）。

A：caspase-3 在尖锐湿疣高危组的阳性表达主要集中于棘细胞层的中部和颗粒层； B：caspase-3 在尖锐湿疣低危 组的阳性表达主要集中于棘细胞的中上层及颗粒层； C：caspase-3 在正常对照组的强阳性表达分布于表皮全层 图 1 尖锐湿疣高危组、低危组和正常对照组 caspase-3 表达水平比较（SP 法染色 ×400）

A：caspase-8 在尖锐湿疣高危组的阳性表达主要集中于棘细胞层的上部和颗粒层； B：caspase-8 在尖锐湿疣低危 组的阳性表达主要集中于棘细胞层的中部和颗粒层； C：caspase-8 在正常对照组的强阳性表达分布于表皮全层 图 2 尖锐湿疣高危组、低危组和正常对照组 caspase-8 表达水平比较（SP 法染色 ×400）

A：survivin 在尖锐湿疣高危组的强阳性表达主要集中于棘细胞层和基底层； B：survivin 在尖锐湿 疣低危组的阳性表达主要集中棘细胞层； C：survivin 在正常对照组中不表达 图 3 尖锐湿疣高危组、低危组和正常对照组 survivin 表达水平比较（SP 法染色 ×400）

3 讨 论

HPV 是一组感染上皮细胞的圆形、 双链 DNA 病 毒，根据它的 Li 基因序列差异，可以将其分为 100 多 种基因型，其中>30 种可以在男女生殖器感染和传播， 引起 CA。Vonetta 等[10]将感染 CA 后易引起女性宫颈恶 变的 HPV-DNA 类型称为“高危型”， 不易引起恶变的 称为“低危型”。 细胞凋亡信号转导主要分为 2 条途径： 线粒体途 径（又称细胞内途径）和死亡受体途径（又称细胞外途 径）[11]，caspase-8 在死亡受体途径中发挥促凋亡作用， 位于级联反应的上游[12]。 Caspase-3 蛋白是重要的细胞 凋亡执行蛋白，位于 caspase-8 蛋白的下游，它的表达 不但反映了细胞的凋亡水平， 同时也反映了凋亡启动 因素的存在[13]。 本研究中 caspase-8 和 caspase-3 在 2 组 CA 组织中表达均较正常对照组降低，提示 HPV 可 能通过抑制 caspase-8 和 caspase-3 的表达，降低宿主 细胞的凋亡， 延长表皮细胞的寿命。 而 caspase-8 和 caspase-3 在高危组的阳性表达率（13.33%、16.67%）低 于低危组（43.33%、40.00%），结果表明高危组的细胞 凋亡可能较低危组减少， 提示高危组更倾向于恶性增 生， 这可能也是感染高危型的女性易患宫颈癌的原因 之一。 Wei 等[14]报告 95%的侵袭性宫颈癌与感染 HPV 高危型有关。 Survivin 又称生存素， 是 1997 年被发现的凋亡抑 制家族 IAP 最小成员，它在成人正常的子宫内膜、肾上 腺髓质、 睾丸、 甲状腺及胎盘中均有部分表达或低表 达，在恶性肿瘤[15]中常见高表达。 本实验在正常对照组 中未检测到 survivin 阳性表达，在 2 组 CA 组织中 sur－ vivin 呈高表达。 在 CA 高危组中（76.67%），survivin 的 表达比 CA 低危组（43.33%）明显增高。Survivin 在高危 组的过度表达， 可通过抑制凋亡蛋白 caspase-3 及 caspase-7 的表达，阻断细胞周期 G2/M 期，从而抑制 细胞凋亡[4]。 Survivin 也可能通过细胞逃避免疫监视， 抑制细胞凋亡，survivin 的表达与肿瘤关系密切， 其表 达增高可抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖， 肿瘤病程 的进展与 survivin 的表达密切相关[16]。 在肿瘤的发展过 程中，高水平的 survivin 表达可使肿瘤细胞向去分化方 向发展，并使其发展成不同的肿瘤组织，本研究高危组 中 survivin 的表达率高达 76.67%， 这可能预示着高危 组中的阳性细胞正向肿瘤进展。Nand 和 Chandrabhan[17] 发现检测 survivin 及其剪接变异体不仅表明癌症的发 生、维持和癌症的进展，也能发现癌症所处的阶段。 由于本研究样本量较少，研究结果具有一定局限性。

关于 caspase-3、caspase-8 及 survivin 在高危型和低危 型 CA 组织中的表达，有待扩大样本量进一步研究。

参考文献略。

来源：张胜伟，陆海涛，周青云，王海飞等，免疫组化法检测 HPV 高危型与低危型尖锐湿疣组织中凋亡相关蛋白的表达[J].临床皮肤科杂志，2018,47（2）：82-85

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