共聚焦激光显微内镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）是一种将共聚焦激光显微镜整合于传统内镜的新型内镜下显微成像技术，可在内镜检查的同时进行实时组织学诊断，通过动态观察放大1000倍的特定组织表面的细胞、血管、基底膜及间质等形态和结构，实现内镜下的“光学活检”。

近年来，对于CLE的研究领域多在食管及胃肠道，包括：诊断巴雷特食管伴上皮内瘤变；识别并实时监测食管和胃黏膜的不典型增生，发现癌前病变；识别肠上皮化生，发现早期胃癌；检测幽门螺杆菌（HP）及HP相关性胃炎；诊断炎症性肠病；鉴别肠道息肉的良恶性等。相对于胃肠疾病，CLE在胆道胰腺领域的应用开展较晚，目前的研究显示其主要用于常规检查方法下诊断率较低的3类胆胰疾病，即不确定性胆管狭窄、胰腺囊性病变（pancreatic cystic lesions，PCLs）和胰腺实质性病变（solid pancreatic lesions，SPLs）。本研究主要对CLE在胆胰疾病诊断中的应用现状进行总结。

一、CLE的分类和基本原理

目前，CLE主要有2种系统，一种是Pentax显微内镜系统的整合式CLE（endoscope-integrated CLE，eCLE），另一种是Cellvizio显微内镜系统基于探针的探头式CLE（probe-based CLE，pCLE），后者独立的微探头可通过大多数内镜的附件通道。EUS引导下的针式CLE（needle-based CLE，nCLE）的基本原理与pCLE相似，是将亚毫米级的共聚焦微探头预先置入19G穿刺针，可对消化、呼吸系统器官内部及管腔外邻近的组织器官进行显微成像。

共聚焦激光扫描显微镜使用一个共焦针孔阻隔焦距外的光线并以光栅模式扫描，以实现“光学切片”的功能。CLE入射至组织表面的低功率激光束波长为488nm或660nm，eCLE扫描速率为1.6帧/s（1024×512像素）或0.8帧/s（1024×1024像素），扫描深度的动态可调范围在0～250μm，pCLE可换用不同探头以扫描不同深度，每次扫描的光学切片厚度为7μm；eCLE的分辨率为0.7μm，pCLE的分辨率较低，为1～3.5μm；eCLE的视野范围为475×475μm，而pCLE的视野范围在240～600μm。与屈曲性较差的eCLE相比，pCLE的临床应用更加广泛，其优势在于灵活性，可与多种型号内镜适配，且扫描速率快（12帧/s），可连续快速捕捉动态图像。基于细针穿刺（fine-needle aspiration，FNA）的nCLE可对器官囊性或实质性病变、黏膜下病变及淋巴结进行检查，将CLE的应用领域扩展至管腔外的组织器官。

临床上为增强图像对比度，需要使用荧光对比剂，目前应用最广泛的是静脉注射荧光素钠和局部喷洒盐酸吖啶黄。大多数CLE检查使用经静脉注射荧光素钠。荧光素钠无毒、无致突变作用，静脉注射后15s内即可显像，持续作用30min，其阳性着色部位为上皮细胞、血管、基底膜及细胞外基质，但荧光素钠不能穿过细胞类脂膜与细胞核中的酸性物质结合，故不能直接显示细胞核，亦无法观察核质比，因而无法用于异型增生的分级。局部喷洒的盐酸吖啶黄可与细胞核内的DNA等酸性物质结合，更适用于标记表层上皮细胞并显示细胞核，但潜在的致突变风险限制了其广泛应用。

二、CLE在胆胰疾病中的应用现状及研究进展

1. pCLE与不确定性胆管狭窄

胆道系统的多种良恶性病变均可导致胆管狭窄，其中恶性狭窄占63％，最常见的原因为胆管癌。胆管癌平均发病年龄为50岁，然而由于缺乏敏感的检查方法，部分可能获益于早期手术治疗的患者明确诊断时已是晚期，平均确诊年龄超过65岁。因此，早期且准确地鉴别良恶性胆管狭窄对指导治疗和改善预后意义重大。尽管目前有ERCP下组织取样及EUS-FNA等检查方法，但胆管恶性狭窄的术前诊断率仍然较低且检查程序繁复。Navaneethan等比较ERCP术中细胞刷检和组织活检对胆管恶性狭窄的检出率，结果显示二者敏感度分别为45％和48.1％，即使联合应用两种取样方法，敏感度也仅有53.7％～64.8％。Sadeghi等的荟萃分析结果表明，EUS-FNA对胆管恶性狭窄诊断的敏感度为74％～86％。

CholangioFlex共聚焦微探头专用于ERCP术中的pCLE检查，其外径为0.94mm，可经由十二指肠镜或胆道镜的附件通道或导管插入胆管，经静脉注射1～5mL 10％荧光素钠后，将微探头直接置于胆管狭窄或其他可疑病变处，尽可能垂直于黏膜表面进行观察。该微探头与激光扫描仪及共聚焦处理器相连接，可提供胆管壁黏膜表面及黏膜下一定深度（40～70μm）的组织结构和功能的实时在体显微图像，包括上皮细胞、血管密度及动态血流等，以便发现肿瘤性新生血管，即时判断胆管狭窄的性质，这一点在离体组织细胞学检查中无法实现；同时，可对pCLE中观察到的可疑病灶进行靶向活检，有利于克服ERCP术中鉴别胆管狭窄性质的常规诊断方法检出率较低的问题，因此，pCLE被视为胆道镜和组织细胞学检查的重要补充。在初步试验性应用中，Meining等将pCLE通过胆道镜对14例胆管狭窄患者进行胆管内共聚焦镜检，其敏感度、特异度、准确率分别为83％、88％、86％，而组织病理学诊断的相应值分别为50％、100％、79％。此后更多的研究应用ERCP联合pCLE判别胆管狭窄的性质，促使最初的迈阿密分类系统诞生，正常胆管：（1）浅灰色背景中黑色分支状细条纹（宽度＜20μm）构成的网状结构，（2）宽度＜20μm的白色条带（正常血管）；胆管恶性狭窄：（1）宽度＞40μm的黑色条带，（2）宽度＞20μm的白色条带（不规则扩张的新生血管），（3）上皮结构，（4）黑色团块状结构。

Meining等以迈阿密分类为判图标准，通过对102例不确定性胆管狭窄患者的前瞻性研究，验证了ERCP联合pCLE在鉴别胆管狭窄良恶性中的技术可行性和诊断价值，pCLE检出恶性狭窄的敏感度、阴性预测值（NPV）和准确率明显优于传统的组织病理学检查（98％比45％、97％比69％、81％比75％），而特异度、阳性预测值（PPV）稍差（67％比100％、71％比100％），ERCP联合pCLE诊断的准确率显著高于ERCP下组织取样（90％比73％，P=0.001）。随后，Meining等对pCLE诊断胆管狭窄性质进行可靠性评价，分析得出以黑色窄带为良性狭窄特征（Kappa=0.49），以观察到上皮结构为恶性狭窄特征（Kappa=0.56），大部分图像判断标准的结果重复性和观察者间一致性良好。Giovannini等通过ERCP对37位患者的胆总管进行pCLE检查，以pCLE中观察到的不规则扩张血管、黑色宽带和黑色细胞团块预测胆管恶性狭窄，pCLE和标准组织病理学诊断的敏感度、特异度、准确率分别为83％比65％、75％比53％、86％比53％。在鉴别胆管狭窄性质的诊断价值方面，以迈阿密分类为判图标准的多项研究均表明pCLE能够明显提高诊断敏感度（83％～98％），而特异度并不理想（33％～75％）。

为降低假阳性率，巴黎分类在迈阿密分类基础上补充了胆管炎性狭窄的pCLE表现：（1）白色细条带增多（血管充血）；（2）黑色颗粒状结构；（3）腺体间距增大＞20μm；（4）网状结构增粗。为验证上述4条针对胆管炎性狭窄的pCLE诊断标准，Kahaleh等从Meining等前瞻性研究所收集的数据中随机抽取40例pCLE影像资料进行回顾性分析，结果显示巴黎分类的特异度（83.3％比67％）和准确率（82.5％比81％）较迈阿密分类均有所增加，相应的观察者间一致性中等（Kappa=0.37）。Talreja等研究表明pCLE专家运用特征性图像对观察者进行培训能够显著提高其诊断的准确性和可靠性。Slivka等在一项包含112位不确定性胆管狭窄患者的多中心前瞻性研究中综合参照迈阿密和巴黎分类标准，证实pCLE与组织取样相比具有较高的敏感度和准确率（89％比56％、82％比72％），pCLE结合最终组织活检结果的诊断准确率可达88％，这一结论与此前有关研究所报道的结果相似。综合最近的一项系统评价和荟萃分析结果，ERCP联合pCLE用于不确定性胆管狭窄诊断的敏感度、特异度分别为90％～98％、72％～73％。在安全性方面，尽管至今尚无文献对其进行评价，但相关诊断试验均提及未发生与pCLE检查或静脉注射荧光素钠有关的不良事件发生，pCLE诊断不确定性胆管狭窄时可能引起的并发症有待进一步研究。

在鉴别胆管狭窄良恶性方面，现今的新型诊断技术还有Spyglass胆道镜。Yang等通过多中心回顾性对照研究，比较pCLE联合细胞刷检（61/195）与Spyglass胆道镜下定向活检（cholangioscopic targeted biopsies，CB）（134/195）对胆管狭窄患者（n=195）的诊断率，结论为pCLE联合细胞刷检与CB在诊断不确定性胆管狭窄中具有相似的特异度（97.7％比98.5％）、敏感度（81.3％比78.8％）和准确率（86％比89％），而pCLE的优势在于其能实现在体内实时组织学显微成像，提供在常规离体活检中无法获得的动态信息。

2. nCLE与PCLs

PCLs包括组织病理学特征和恶性潜能各不相同的多种类型，准确判定这些病变的性质对患者的治疗方案选择和预后都有非常重要的意义。但现有的检查如MRCP、EUS-FNA及囊液分析包括细胞学、生化及肿瘤标志物检测（CEA、淀粉酶、黏蛋白）等方法对PCLs性质的准确诊断并不理想，其局限性包括：用于细胞学检测和囊液分析的样本量不足，连续监测CEA水平不能准确判别PCLs的性质、预测病变进展等。Thornton等对1438例PCLs患者的荟萃分析结果显示，EUS-FNA联合囊液细胞学和CEA水平检测对于鉴别诊断胰腺黏液性囊肿与浆液性囊腺瘤（serous cystadenoma，SCA）的敏感度分别为54％和63％。不明确的诊断也是导致不必要的手术切除的主要原因，Jais等通过对包括2622例SCA患者的系统性分析，发现SCA是一种很少出现临床症状，生长缓慢、侵袭性罕见的胰腺非黏液性囊性肿瘤，而其非必要的手术率高达36％。nCLE的出现，实现了在EUS-FNA检查过程中实时观察囊肿内部显微结构，有助于PCLs的鉴别诊断。

基于EUS-FNA的nCLE使用AQ-Flex 19共聚焦微探头，其外径为0.85mm，可替代针芯预置于19G穿刺针内，微探头前端伸出穿刺针头端约1mm并用锁紧装置固定，在EUS引导下将微探头插入待检囊性病灶的同时静脉注射2.5mL 10％荧光素钠，获得nCLE成像后，退出微探头进行常规FNA。Konda等最先评估并验证了EUS-FNA引导下nCLE用于诊断胰腺病变的技术可行性和操作安全性，未发生静脉注射荧光素钠相关的不良事件，2例术后并发症分别为轻度和中度胰腺炎。在随后的试验性研究中，Konda等描述了nCLE图像表现及其相应的组织结构：白色条带为血管；黑色分叶状结构为腺泡细胞；灰色卵圆形结构为脂肪细胞；细灰色条纹为胰腺导管上皮下结构；明亮的超细直条纹为纤维束；亮白色颗粒为组织碎片等。该研究发现nCLE中观察到的上皮绒毛状结构（以黑灰色黏液性上皮环及白色血管核心为特点的乳头状突起）与胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤（intraductal papillary mucinous neoplasm， IPMN）显著相关，该特征性结构的特异度和PPV均达到100％，而敏感度、NPV仅为59％、50％。该项初步研究的术后总体并发症率为9％，胰腺炎发生率为3％。

Napoléon等提出SCA的nCLE特征性表现为：浅层血管网，与病理结果观察到的浆液性上皮下“项圈”样毛细血管网相一致。该nCLE图像标准经盲法验证，诊断SCA的准确率、特异度、敏感度、PPV、NPV分别为87％、100％、69％、100％、82％，且可靠性较好（Kappa=0.77）。而后，Napoléon等基于相关病变的组织病理学特点，对除IPMN、SCA之外的PCLs的nCLE下主要表现进行了分类描述：（1）黏液性囊腺瘤（mucinous cystic neoplasm， MCN）：深灰色条带及其黑色细轮廓线（囊壁的黏液性上皮）；（2）假性囊肿（pseudocyst，PC）：亮白色、灰色和黑色颗粒相混合（囊壁的各类炎性细胞，亮白色颗粒为组织细胞碎片，缺乏内衬的上皮层）；（3）囊性神经内分泌肿瘤（cystic neuroendocrine tumor，cystic NET）：不规则的黑色肿瘤细胞簇及周围的灰色纤维血管区。

上述几种PCLs主要类型（IPMN、SCA、MCN、PC）的nCLE图像标准经初步回顾性验证，诊断黏液性囊肿（MCN+IPMN）和非黏液性囊肿（PC+SCA）的特异度高达95％和100％，其中MCN、IPMN、SCA、PC的诊断准确率分别为90％、90％、87％、87％，总体的观察者间一致性较好（Kappa=0.72）。不过，由于存在囊性NET病例数有限（n=2），区分黏液性囊肿中的MCN和IPMN的敏感度较低（67％和80％）以及穿刺针进入囊肿的部位及其附近的囊壁无法用nCLE观察等问题，上述发现还需要进一步研究验证。

此外，Nakai等在EUS-FNA引导下联合应用Spyglass光纤探头和nCLE对30例PCLs患者进行检查，发现Spyglass直视下观察到的黏液和nCLE图像中的乳头状突起、黑色的上皮环均为胰腺黏液性囊肿的特异性表现，与临床诊断结果高度一致，敏感度分别为90％、80％，二者联合应用的敏感度、特异度和准确率均达到100％。

由于PCLs在恶性潜能、囊肿的大小和位置、单房或多房囊腔等方面存在异质性，不同类型的PCLs也可能有相似的nCLE表现，所以应用nCLE实现全面诊断尚有困难。在EUS-FNA联合nCLE对PCLs的诊断价值方面，与pCLE相反，上述试验性研究均提示nCLE具有较高的特异性，而敏感度较差。Fugazza等最近对CLE在胃肠和胆胰疾病中的应用现状进行了系统性综述，其中nCLE用于诊断PCLs的敏感度、特异度分别为68％、90％。在可靠性方面，Karia等以血管、绒毛状结构、黑色团块、网状结构、腺泡细胞、细胞碎片为变量衡量其观察者间一致性，相应的Kappa值为-0.04，0.16，0.22，0.13，0.14，0.06，其平均准确率仅为46％（20％～67％）。因此，以往所建立的nCLE图像标准在PCLs中的诊断价值、可靠性以及与nCLE潜在相关的并发症还有待进一步研究和验证。

3. nCLE与SPLs

胰腺癌是全世界第四大癌症相关死亡原因，早期发现和准确诊断对其预后非常重要，尤其是需要优先鉴别胰腺癌和其他良性病变如伴肿块形成的慢性或自身免疫性胰腺炎。EUS-FNA被认为是目前诊断SPLs的重要检查方法，但存在取样误差和组织样本质量不佳、多次操作增加并发症的发生风险、对现场细胞病理学评价的要求较高和受病灶大小影响等限制因素。最近，EUS-FNA联合nCLE在诊断SPLs中的应用，使得共聚焦微探头获得组织细胞的显微图像后，在提示恶性病变的区域内进行针吸活检，可大大降低FNA的未检出率。

相较于pCLE用于鉴别良恶性胆管狭窄及随后的nCLE用于诊断PCLs，EUS-FNA联合nCLE用于诊断SPLs的研究开展较晚，其操作方法与EUS-FNA引导下nCLE诊断PCLs基本相同。Kongkam等通过对22位SPLs患者的前瞻性试验研究提出了用于鉴别SPLs性质的nCLE图像标准：恶性病变：黑色细胞团块（＞40 μm）伴或不伴血管扩张；良性病变：白色的纤维化条带伴有正常的腺泡细胞。EUS-FNA联合nCLE诊断SPLs良恶性的准确率可达90.9％，观察者间一致性较理想（Kappa=0.82）。Giovannini等通过分析14例获得明确病理学结果的SPLs患者的nCLE录像，进一步完善了对胰腺癌的nCLE特征性表现的描述：形状、大小和边缘不规则的黑色细胞团块、不规则的血管伴血管荧光池。同时，首次描述了慢性胰腺炎（灰色的纤维组织背景中残留有正常的黑色腺泡结构）和实性NET （黑色细胞索被白色纤维化区包围）的nCLE图像特征，其中，实性NET的图像特征与此前Napoléon等所描述的囊性NET非常相似。以上3类SPLs的nCLE图像标准随后经回顾性盲法验证，75％的病例（24/32）获得明确的nCLE结果，其中96％（23/24）诊断正确，统计学评价显示其用于诊断胰腺癌、慢性胰腺炎、实性NET的准确率分别为85％、91％、97％，对于SPLs的分类诊断具有很高的特异度、NPV及PPV，且观察者间一致性中等（Kappa=0.55）。

此外，有研究显示EUS-FNA获得正确诊断所需的最佳取样数为5～7次，而EUS-nCLE仅需1～2次，中位操作时长8 min，并且不需要细胞病理学专家对标本进行现场快速评估。不过，对于nCLE在肿块形成型慢性胰腺炎及其他SPLs中的诊断价值和可能的并发症都有待进一步研究，以获得更多相关的特征性图像。

三、结论

从宏观的大体形态学到微观的组织病理学，共聚焦激光显微内镜获得的实时体内组织形态和结构信息有助于即时判断胆胰病变的性质，从而对可疑病灶进行靶向活检，有效减少活检次数，优化以往繁复的检查程序，使胆胰疾病的早期高效诊断和对患者个体化的“精准医疗”成为可能。

处于初步试验性应用阶段的nCLE虽然存在一些不足之处，如判别MCN和IPMN的敏感性和准确性较低，原有图像标准的观察者间一致性不佳等，却也具有更深入的研究价值，如应用nCLE识别MCN的特征性结构卵巢型基质、在nCLE下区分IPMN的亚型（胃型、肠型、胆胰型、嗜酸性细胞型）、鉴别壁结节和黏液凝块、诊断肿块形成型慢性胰腺炎等。

随着新型荧光对比剂的研发，CLE亦显现出广阔的应用前景：使用新型荧光对比剂指导靶向活检，如将特异性抗体与荧光剂结合，识别肿瘤细胞及其标志物；在治疗方面的应用，如用荧光剂标记化疗药物，在CLE下监测其分布，达到实时示踪及靶向治疗的目的；以及更清晰地显示细胞核及其他亚细胞结构，对不典型增生进行分级等。

来源：闻珺,李涛,龚彪.共聚焦激光显微内镜在胆胰疾病中的应用现状[J].中华消化内镜杂志,2017,34(10):748-752.