前言
第28届中国临床肿瘤学会（CSCO）学术年会上，抗体药物偶联物（ADC）在
研究方法
研究主要关注三种用于乳腺癌治疗的重要细胞毒性有效载荷——德鲁替康衍生物、奥瑞斯他汀和美登素衍生物。常见的德鲁替康变体，特别是S-8201a（DXd1）和DXd2，衍生自Exatecan，是多种ADC的关键组成部分。德鲁替康作为一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，因其能够在癌细胞中诱导DNA损伤而备受关注。奥瑞斯他汀类载荷，包括单甲基奥瑞斯他汀E和F（MMAE和MMAF），属于强效的微管破坏剂，能有效阻滞细胞分裂并引发癌细胞凋亡。美登素衍生物类载荷是首个获批用于实体瘤治疗的ADC——
研究结果
研究旨在阐明有效载荷的电离状态和连接子的存在如何影响ADC的旁观者效应。具体而言，研究探索了具有不同电荷状态和连接子大小的有效载荷是否能够被动扩散通过脂双层，此外还评估了其他参数对旁观者效应可能性的潜在影响，包括氢键形成能力、自由能垒（如翻转
研究考察的部分有效载荷（图1）含有在生理pH值（5-7）下可电离的基团。为确定在这些条件下有效载荷的电离状态，研究进一步评估了它们相应的pKa（酸解离常数Ka的负对数）值。具体而言，DXd2含有一个烷基氨基，会质子化形成–NH₃⁺；而MMAF含有一个羧酸根基团，在这些pH水平下保持去质子化状态。此外，不可裂解连接子与有效载荷的组合Lys-SMCC-DM1则可能在溶酶体消化后产生两性离子。在下文的描述中，这些分子均被视为根据pKa分析确定的电离状态。
图1 不同载荷的化学分子结构
计算得到的可电离分子的pKa值如下：DXd2，10.4±2.4；MMAF，2.2±0.9。Lys-SMCC-DM1有两个可电离基团，计算得到的pKa(COO−)=2.2±0.9和pKa(NH₃⁺)=9.0±0.9。结果表明，在生理pH下，DXd2呈质子化状态，MMAF呈去质子化状态，而Lys-SMCC-DM1呈两性离子状态。
理解有效载荷跨脂双层的被动扩散需要评估其跨膜翻转和从膜-水界面解吸附两个过程。研究进行了广泛的MD模拟以捕获稳态构型，随后进行了平均力势计算，以量化跨膜翻转和离开双分子层解吸附的自由能垒。
图2a示意性说明了模拟中靶向的被动扩散过程。在ADC内化并在肿瘤细胞内释放细胞毒性药物后，旁观者效应可能通过有效载荷跨脂双层的被动扩散进行（图2b）。所有案例中使用的脂双层结构均由64个1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱（POPC）分子组成。在所有案例中，无约束的MD模拟均导致有效载荷吸附在脂质极性头部与双层下部（细胞外）叶片的烃核心之间。
图2 旁观者效应与计算机模拟示例
图2c中以MMAE和MMAF为例，分别展示了有无旁观者效应的情况。所有分子相对于脂层的分布情况相似，与图中所示视觉呈现一致。图 2d 呈现了所有系统沿双层法线的平均质量密度分布，反映了模拟过程中载荷在双层内部的相对定位。这些有效载荷分子是两亲性化合物，能够舒适地分配在其中一个脂质叶片的双亲界面上。所有有效载荷都含有氢键供体，可与脂质分子中的氧原子受体（磷酸基团的两个非桥氧原子及酰基链的两个羰基氧原子）形成氢键。
表1列出了每个有效载荷中可用的氢键供体数量以及在生产轨迹上平均的氢键数量。如预期所示，质子化分子DXd2和Lys-SMCC-DM1的氢键数量高于未质子化的DXd1和DM1，这归因于胺基中的额外氢原子及其与带负电脂质磷酸基团的几何邻近性。
表1 研究中的细胞毒性载荷特征
图3a显示了所研究的每种有效载荷在模拟时间内氢键出现次数的统计情况。具有和不具有旁观者效应的载荷之间的关键差异在于后者存在带电基团——这些带电基团可与脂质分子的带正电胆碱基团和/或带负电磷酸基团发生静电相互作用（图3b，提取自多个MD快照）：带正电的NH₃⁺基团始终与POPC磷酸基团保持<0.5nm的距离，且胺基氢可与脂质尾部的羰基氧形成氢键（表1、图3b）；MMAF带负电的羧基与带正电的胆碱基团存在持续相互作用；两性离子Lys-SMCC-DM1则同时存在上述两种相互作用。
图3 氢键与静电相互作用对旁观者效应的影响
研究计算了扩散过程中两个关键步骤的平均力势值，即有效载荷跨双层内部的“翻转”和从脂双层的“解吸附”。翻转和解吸附步骤的PMF模拟均从无约束MD模拟获得的初始结构开始（图2c）。图3d描绘了每个有效载荷分子的组合PMF，说明了它们在翻转和解吸附过程中相对于脂双层表面的垂直移动（方向相反）。表1作为补充资源，提供了这些步骤计算出的ΔG能垒。
三类载荷的共同特征是：电离态分子穿越疏水双层相时存在高能量垒（DXd2为80kJ/mol，MMAF为75kJ/mol，Lys-SMCC-DM1为65kJ/mol）。这一现象是药物膜通透性的典型特征，可解释此类载荷缺乏旁观者效应的原因。相反，已被证实具有旁观者效应的电中性载荷（DXd1、MMAE、DM1）的能量垒显著更低（DXd1为20kJ/mol，MMAE为15kJ/mol，DM1为20kJ/mol）。
连接子裂解后的载荷的解吸附能垒为40-55kJ/mol；两性离子Lys-SMCC-DM1的解吸附能垒更高（约75kJ/mol）。值得注意的是，未裂解连接子的载荷（DXd1-连接子、SMCC-DM1）的翻转扩散能垒相对较低（分别为20kJ/mol和25kJ/mol），但解吸附能垒显著高于其他分子（DXd1-连接子为80kJ/mol，SMCC-DM1为75kJ/mol）。
Lys-SMCC-DM1、DXd1-连接子和SMCC-DM1的行为相似性表明，连接子的影响超出了单纯的可电离基团作用。疏水性和分子大小是已知的影响分子通透性的因素（表1）。有趣的是，分子大小与解吸附过程呈负相关：未裂解连接子的载荷（Lys-SMCC-DM1、SMCC-DM1、DXd1-连接子）的Rg值更大，其解吸附ΔG值也更高（表1、图3e）。然而，AlogP模型计算的疏水性对翻转扩散和解吸附步骤的影响似乎较小——例如，尽管DXd1和MMAE的AlogP值差异显著（分别为-0.25和3.10，表1），但它们的翻转扩散ΔG值相近（分别为20kJ/mol和15kJ/mol，表1）；DM1、SMCC-DM1和DXd1-连接子的AlogP值（分别为3.0、7.1和1.05，表1）与其翻转扩散ΔG值（分别为20kJ/mol、25kJ/mol和20kJ/mol，表1）也呈现类似趋势。
讨论与总结
本研究通过计算机模拟揭示了ADC旁观者效应的关键分子决定因素。结果表明，有效载荷的电离状态是影响其被动扩散通过脂双层能力的首要因素：中性有效载荷（如DXd1、MMAE、DM1）因跨膜翻转能垒低而易于扩散，展现出旁观者效应；而带电或两性离子形式（如DXd2、MMAF、Lys-SMCC-DM1）则因极高的翻转能垒而被限制在膜内，可能难以发挥该效应。此外，连接子的设计（大小、疏水性及可裂解性）直接影响有效载荷从膜中解吸附的效率，简洁可裂解的连接子更利于载荷释放，而庞大或疏水性强的连接子则会显著提高解吸附能垒，从而阻碍药物最终释放至邻近细胞。综上，为实现最佳的旁观者效应，ADC的合理化设计应致力于确保有效载荷在生理环境下呈电中性，并尽可能简化连接子结构以降低其空间位阻和疏水性。这些见解为提升药物对异质性肿瘤的杀伤效果、降低脱靶风险提供了精准指导。未来，通过进一步探索膜组分（如胆固醇）对 ADC 转运的影响，可进一步完善跨膜扩散机制的认知，有望为下一代高效 ADC 疗法的研发奠定更坚实的基础。
本文由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考，不可用于推广目的。
审批编号：CN-172614
有效期至：2026/11/23
参考文献
[1] Cruz VL, et al. In silico decrypting of the bystander effect in antibody-drug conjugates for breast cancer therapy. Sci Rep. 2025 Aug 6;15(1):28715.
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