胃癌是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一。胃癌患者往往因诊断延迟而错失最佳治疗时机，导致疗效受限和生存预后不佳。因此，开发能够实现早期诊断的可靠生物标志物成为当前研究的重点。循环细胞外囊泡作为一种稳定的核酸载体，在体液中富集，尤其携带多种小非编码RNA，这些RNA在肿瘤发生与发展中具有重要调控功能。然而，以往研究多集中于miRNA等经典小RNA，而对非经典小非编码RNA（如核糖体RNA来源的rsRNA和转运RNA来源的tsRNA）在胃癌诊断中的潜力了解甚少。由于这类RNA分子通常带有丰富的转录后修饰，使得传统测序方法难以有效检测，其在血浆细胞外囊泡中的表达谱及诊断价值尚待探研究结论索。

本研究采用PANDORA-seq技术，该技术能够克服RNA修饰对常规测序的影响，实现对血浆细胞外囊泡中小非编码RNA的全景分析。研究首先纳入30例胃癌患者和30例健康对照的血浆样本，提取细胞外囊泡并构建小RNA文库，系统鉴定包括miRNA、piRNA、rsRNA、tsRNA在内的多类小非编码RNA。通过差异表达分析，筛选出在胃癌中显著异常表达的非经典小非编码RNA。

利用PANDORA-seq对30例胃癌患者和30例健康对照的血浆细胞外囊泡RNA进行分析。测序共鉴定出197种miRNA、519种piRNA、12,789种rsRNA、1,553种tsRNA以及787种其他小非编码RNA。通过差异表达分析，研究人员发现胃癌患者与健康对照之间存在显著的小非编码RNA表达谱差异，并进一步筛选出43个满足严格阈值（每百万读数>10，变化倍数>10）的显著差异表达小非编码RNA。其中表达上调最显著的10个小非编码RNA包括4种tsRNA、5种rsRNA和1种piRNA。在独立训练队列（24例胃癌 vs 24例对照）中，通过RT-qPCR对初筛得到的10个上调小非编码RNA进行验证，确认其中6个在胃癌患者中稳定高表达。

在更大的验证队列（119例胃癌 vs 143例对照）中进一步评估，最终确定由三种rs/tsRNA（标识为S2，S7，S10）组成的核心标志物。诊断效能评估显示，该三分子标志物在合并的训练和验证队列（143例胃癌 vs 167例对照）中区分胃癌与健康对照的受试者工作特征曲线下面积达到0.91，敏感性为80.42%，特异性为87.43%。该标志物对早期胃癌（Stage I）同样表现出优异的诊断性能，曲线下面积为0.88，敏感性和特异性分别为81.97%和81.44%。

为评估其临床应用前景，研究人员构建了随机森林模型。结果显示，仅包含三种rs/tsRNA的模型诊断效能（曲线下面积0.95）显著优于基于临床蛋白标志物（CA19-9, CA125, CEA, AFP）的模型（曲线下面积0.70）。将分子标志物与临床指标整合后，模型性能达到最优（曲线下面积0.95），且整体敏感性提升至83.9%。该三分子标志物的稳健性在两个独立的测试队列中得到了进一步证实（队列1：47例胃癌 vs 47例对照；队列2：40例胃癌 vs 43例对照），其联合诊断的曲线下面积分别高达0.97和0.91。此外，对20例胃癌患者术后的动态监测发现，手术后这些rs/tsRNA的水平显著下降，提示其潜在用于监测肿瘤残留或复发。

为探究这三种关键rs/tsRNA的生物学功能，研究进行了深入的机制探索。通过生物信息学工具（RNAhybrid和miRanda）预测了潜在靶基因。分析表明，这些靶基因显著富集于多个癌症相关通路，特别是ErbB信号通路和Hippo信号通路。双荧光素酶报告基因实验证实了这些rs/tsRNA与预测靶点之间存在直接相互作用：S2可结合ErbB通路中的CDKN1A/PAK3以及Hippo通路中的NF2/TEAD3/LATS1；S7靶向Hippo通路中的SMAD4/BMP5；S10则与ErbB通路中的NRG4/PRKCA以及Hippo通路中的LMD1/PPP2R1B/WTIP结合。

在胃癌细胞系（MKN-45和AGS）中进行的Western blot实验进一步验证，过表达这些rs/tsRNA能够有效调控其相应靶标及ErbB/Hippo通路下游关键蛋白的表达。这些结果共同揭示了该rs/tsRNA标志物通过调控关键致癌通路参与胃癌发病机制的分子基础。

本研究首次利用PANDORA-seq技术系统解析了胃癌患者血浆细胞外囊泡中非经典小非编码RNA的表达谱，发现了一个由三种rs/tsRNA构成的分子标志物，该标志物在多个独立队列中均表现出优异的胃癌诊断性能，尤其在早期胃癌中具有重要应用潜力。此外，该标志物参与调控ErB/Hippo等关键肿瘤相关通路，揭示了其在胃癌发生发展中的潜在生物学功能。该研究为胃癌液体活检提供了新的候选标志物，有望在未来用于辅助早期筛查、风险分层及治疗监测，但其临床应用价值仍需通过大规模前瞻性研究进一步验证。

参考文献：

1. Yang P, Li Z, Chen X, et al. Non-canonical small noncoding RNAs in the plasma extracellular vesicles as novel biomarkers in gastric cancer. J Hematol Oncol. 2025;18(1):39.