作者：鲍萍萍，天津市口腔医院第一门诊部；邓嘉胤．天津医科大学口腔医学院
根管生物膜对于各种抗菌措施和宿主免疫有较强的抵抗力，是导致感染持续存在、根管治疗失败的重要原因。由于临床试验的局限性，新研发的根管抗菌策略如冲洗剂、冲洗技术、根管封药等均需先进行严格的体外研究评估其有效性和安全性。
建立体外根管生物膜模型检验新抗菌策略去除/杀灭细菌生物膜的效果是有效性研究的重要内容。体外构建根管生物膜模型有利于实现研究标准化，可根据研究目的选择感染菌种、模拟不同感染状态的生物膜、控制各种影响因素，可允许较高的样本量和重复性。本文就近年来根管感染控制研究中常用的根管生物膜体外模型进行综述，讨论模型构建的各项因素，以期为学者开展相关研究提供参考。
1.生物膜的细菌组成
迄今多数研究采用单菌种生物膜模型，粪肠球菌是最常用的感染菌种。单菌种模型简单，易于建立，标准化和重复性好，允许有较高的样本量。粪肠球菌在根管治疗失败尤其是持续性感染根管中有较高的检出率，曾被认为是导致治疗失败的主要病原菌；可耐受广泛的生存条件，在实验室环境下易于培养且生长快速，因而最常被选用。
近年来其主要致病作用受到质疑，因为亦有很多失败病例根管中并未检出粪肠球菌的存在，即使存在也不是优势菌，它在一些根管治疗后未发生疾病的根管中也有较高的检出率。因而，可以说明粪肠球菌具有较强的抵抗根管治疗抗菌措施并在根充后营养匮乏环境中适应生存的能力，但不能证明它是导致治疗失败的主要病原菌。
成熟的培养技术和分子生物学研究已揭示根管感染为多种细菌的混合感染，不同菌种间有复杂的相互作用，形成的多菌种生物膜具有更强的代谢能力、毒性、对外界环境和抗菌药物的抵抗力、自我恢复能力，以及更难去除性。因此，仅采用单菌种模型评估抗菌效果的研究结果是片面的，仅建议用于冲洗剂/消毒药物研究的早期筛选。
将多个已知菌种混合培养形成的生物膜为定义的工程生物膜(defined engineered biofilm)，由实验室菌株或临床根管细菌分离菌株形成，通常根据菌种的可获得性及菌种间兼容性选择少数几种细菌组合培养。这种生物膜的优点在于组成的菌种已知，重复性好，易于操控和分析。
关于菌种选择，应选根管微生物群中的典型菌。原发性感染根管中，革兰氏阴性(G-)菌最常见，一些革兰氏阳性(G+)菌也常检出；根管预备和封药后G- 菌显著减少，G+ 菌(如链球菌、粪肠球菌等)则有较高检出率，说明G- 菌在治疗中易被去除，G+ 菌更能抵抗治疗措施并能在根备和封药后的恶劣环境中适应生存，去除难度更大。
一种治疗方法对G-/G+ 菌可能有不同的效果，建立多菌种模型时应同时包括。原发性感染根管内专性厌氧菌最多，而持续性或继发性感染根管中专性厌氧菌和兼性菌均占主导地位，建模时应同时包括。
实验室菌株具备已知的基因组序列和特性，易于获得和培养，但由于多年传代毒性弱于临床菌株。临床分离株更能代表体内情况，但其取样和培养过程也更复杂。这种定义的多菌种模型比单菌种模型更接近体内，但依然无法复制自然根管群落，比如无法纳入尚未培养的菌种。
还可以直接从自然环境中提取微生物培养生物膜，其微生物组成未知，称为未定义的自然生物膜(undefined natural biofilm)。常用方法有在感染根管中直接取样、采集志愿者龈上/龈下菌斑、或通过志愿者在口内佩戴特殊装置利于口腔菌群形成。这类生物膜(尤其是根管取样培养)的细菌组成更接近天然牙感染根管，菌种间的相互作用和代谢合作也更接近体内。然而，由于微生物组成的未知性、多样性及异质性(不同供者、采样部位均有其特异性)，很难确定最适宜的培养基、氧气条件和培养时间，一些菌种(如不可培养的)可能会在实验流程中丢失，从而影响模型的标准化和重复性。每个样本具体的微生物组成需通过16SrRNA 等现代分子技术确定。
2.载体的选择和预处理
2.1 载体材料
天然牙本质和各种人工合成材料均可用于建立体外生物膜模型。合成材料主要有玻璃、聚苯乙烯、
合成材料载体的优势在于易于实现样本在大小、形状、组成和表面特征等方面的标准化及高样本量。然而，合成材料表面缺乏细菌粘附所需的有机受体(如牙本质胶原蛋白)，生物膜形成的初始阶段会发生改变，从而影响生物膜的结构和组成。合成根管多具有光滑的管壁表面、规则的圆形截面和直线入路，与临床情况明显不同，可能会影响冲洗液在根管内的流体力学，难以重现牙本质微观解剖(如牙本质小管)以及冲洗剂和牙本质间的化学作用(如次氯酸钠溶液中游离有效氯的消耗及EDTA螯合作用导致的生物膜细菌分离)。
羟基磷灰石表面结构与牙釉质相同，有利于细菌粘附和定植，是常用的载体材料。Swimberghe等发现，在微量滴定板上生长的多菌种生物膜比在羟基磷灰石或牙本质表面上生长的多菌种生物膜对次氯酸钠更为敏感，后两者间无明显差异。因此，以合成材料为载体建模适用于对抗菌药物或措施效果评价的初步筛选。
人牙本质是建立生物膜模型的首选载体。牙本质拥有独特的有机和无机成分，如磷酸盐具有缓冲作用可调节生物膜pH 值；独特的解剖结构，如牙本质小管、管周及管间牙本质，难以被模仿或复制。当使用人离体牙建模时，需注意样本在根管形态等方面的匹配，还需考虑供体年龄，因为牙本质有增龄性改变，渗透性相应降低，可能影响研究结果。
Ozdemir等比较了粪肠球菌在年轻和老年人根管牙本质上的粘附情况，发现老年牙本质上有更明显和更厚的生物膜形成。来自同一供者的配对拔牙可减少因牙本质成分、结构、矿化程度等因素造成的差异，但难以获得足够有效样本。由于诊疗水平提高及伦理等因素，人离体牙的收集越来越困难。
牛牙在形态、物理性质和化学成分等方面与人牙相似，收集相对容易，可实现年龄、饮食等环境条件标准化，而且体积大，易于操作，在研究中的应用逐渐增多。不过牛牙本质与人牙本质还是略有不同，如矿物质含量和胶原交联水平较低，牙本质小管的数量更多。因此，使用牛牙本质作为替代品尚需进一步验证。
2.2 载体的几何形态
将离体牙的冠与根尖部分切除可制成牙本质块表面感染模型，标准化的几何形状和样本感染提高了模型的重复性。一颗牙齿可制成1个或多个牙本质块，可在随机化前进行样本匹配。牙本质块不具备根管形态，无法体现根管几何三维形态对于抗菌措施的影响，因此，该模型仅建议用于抗菌药物或方法的前期研究。
牙本质块还可制成牙本质小管感染模型，通过离心将细菌推入牙本质小管，较短时间即可获得大量细菌深入且均匀分布的牙本质小管重度感染模型，应用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)和活/死细胞荧光染色可直接观察细菌侵入牙本质小管的深度及定量评估抗菌效果。
不过，这种感染方式与体内不同，一些细菌如专性厌氧菌可能无法耐受离心过程而丢失。另外，由于根尖硬化区牙本质小管难以感染，这类模型制备常采用年轻恒牙牙根的冠1/3，研究结果不能直接推理到根尖1/3，为解决该问题，Al-Zuhair等建立了一种新模型，将2个制备好的牙本质块放入“模拟根管”(1mL注射器制成)内不同位置以代表根管冠及尖1/3感染牙本质。
应用离体牙根管建立生物膜模型比牙本质块更接近体内实际。多数研究采用单根管离体牙或多根牙的某个根进行生物膜培养。样本根管需具有相似的几何形态和解剖结构，多采用CBCT或Micro-CT筛选确认，进行初步机械预备以保证根尖段初始直径标准化。
虽然在未行预备的根管内生长的生物膜更能代表体内实际，但是未预备的根管接种相对困难，尤其是细窄根管难以将接种培养基引入至整个根管空间。在未预备的根管内采样进行微生物学评价亦同样困难。因此，在接种前进行根管初预备是有意义的。切削根管壁产生的玷污层需在接种前去除干净。
为了便于生物膜的培养和观察，一些研究将离体牙纵向劈开成对称的2个半片，或人工合成半片根管模型，培养生物膜后将2个半片重新复位进行处理，之后再分开评价根管壁生物膜残留情况。为了更好地还原根管解剖结构的复杂性，有研究在根尖段根管壁人工制作窄沟以模拟鳍状沟或制作侧支根管以评价抗菌措施去除不规则区生物膜的效果。此类模型2个半片复位后需注意严密封闭以避免冲洗剂和细菌沿侧方渗漏，应用密封膜可有效减少渗漏。
使用计算机辅助设计和3D打印建立根管模型是近年来出现的一种新方法，可更真实还原天然牙根管复杂的解剖形态，可实现模型高度标准化，材质透明的模型还可实时观察冲洗剂在根管内的流动以及和生物膜去除之间的相互作用。
2.3 载体的灭菌
为保证样本接种前初始条件标准化，载体需消毒灭菌。理想的灭菌方法要求100%无菌的同时不影响样本的理化和生物性能，不破坏样本的结构完整性。目前已报道的灭菌方法有高温高压蒸汽灭菌、环氧乙烷熏蒸、
如果样本在灭菌前应用EDTA等螯合剂去除玷污层，高温高压可导致暴露的胶原纤维变性分解，从而影响牙本质的渗透性和细菌粘附。γ射线照射对于牙本质无明显不良影响，可能是一种具有潜力的灭菌方法，应用逐渐增多。
由于根管细窄且解剖结构复杂，环氧乙烷、过氧化氢、以及各种消毒液浸泡法灭菌效果均不理想，而且可能干扰细菌粘附。灭菌方法的选择也取决于研究目的及可获得的实验室条件。无论选择哪种方法，均建议进行无菌验证。
2.4 载体表面的预处理
载体材料的化学性质可影响细菌的初始粘附和生物膜结构，接种前对载体表面进行预处理，即涂覆唾液、胶原蛋白、牛血清蛋白或黏蛋白等，可模拟自然吸附于牙本质表面的获得性膜，促进细菌的初始粘附和生物膜生长。合成载体如羟基磷灰石片需进行预处理。牙本质载体自身含有胶原蛋白，但高温高压灭菌过程可造成胶原蛋白变性，亦建议预处理。使用EDTA可使牙本质胶原蛋白暴露，促进细菌粘附。哪种预处理方案最佳目前尚无定论。
3.细菌接种与培养
3.1 细菌接种
接种方法主要有4种：(1)整个样本浸于接种培养基中；(2)将接种培养基引入根管；(3)使用流动池，接种培养基持续通过根管；(4)口腔常驻菌群的自然接种。接种培养基是通过在液体培养基中添加接种菌获得，接种菌浓度通常为104~1010 CFU/mL，108 CFU/mL最常用。
当接种菌液只引入根管时，生物膜只在根管内生长，注意避免产生气泡，使菌液充满整个根管空间。当整个样本浸于接种菌液时，外表面也会生长生物膜。第4种方法是将已开髓且灭菌的离体牙安放在特定装置上，通过志愿者在口内佩戴数天对离体牙根管进行自然感染，这种方法有一定局限性，需要志愿者坚持佩戴并遵循饮食建议。
3.2 培养基的选择和更新
脑心浸液是最常用的培养基，
原发性根管感染与牙髓治疗后持续性或继发性感染相比，微生物组成与生存环境截然不同。应激/饥饿生物膜相比于非应激/非饥饿生物膜对于营养匮乏等不利条件以及抗菌治疗抵抗力更强。因此，在实验设计时应根据研究目的建立相应的模型。如模拟原发性感染，应选用高营养培养基并定期及时更新以保证持续充足的营养供应以及悬浮死细胞和代谢废物的清除，同时给予适宜的温度湿度条件；模拟持续性或继发性感染，则选用营养不足的培养基或限制培养基的更新，营养越来越匮乏，代谢产物和有毒废物的浓度不断增加，膜内细菌的代谢活动下降，从而建立应激/饥饿生物膜模型。
生物膜在静态和动态环境中均能培养。动态培养即将样本放在特定装置中，培养基有控制地持续流动补给新鲜营养的同时带走旧的培养基和代谢废物。体内环境中炎性渗出液在根管内流动非常缓慢，对根管壁所施加的剪切力很可能不足以影响生物膜的形成。因此，静态培养似乎更接近体内，两者均不能完全复制体内感染的实际情况。
3.3 培养时间
时间是生物膜形成和发育成熟的重要条件。与仅培养了数小时或数天的年轻生物膜相比，成熟生物膜的厚度、结构复杂性、对于抗菌剂的耐药性以及清除难度均显著增加。临床上需行根管治疗的患牙根管生物膜通常已形成了数周、数月甚至数年。因此，在进行体外研究评估抗菌措施效果时建立成熟生物膜模型更有意义，使用年轻生物膜则会得出高估的结果。不同生物膜模型培养至成熟所需时间与其自身特点和环境条件相关，建议在启动研究前进行生物膜生长动力学分析。
4.生物膜培养成功确认
鉴于上述因素均可影响生物膜的形成，培养结束后需确认是否培养成功。
CLSM 可实现生物膜的三维重建和定量分析，结合LIVE/DEAD荧光染色可区分显示活/死细菌。光学显微镜分辨率低，结合组织学染色可区分G+/G- 菌，不能区分活/死细菌。部分研究采用细菌培养或比色法确认细菌活性。
5.总结与展望
所有新型抗菌药物、技术和方法均需先进行体外研究评估其有效性，根据研究目的选择恰当的体外根管生物膜模型，谨慎设计其构成的各项因素是非常重要的。简单的模型如单菌种模型、牙本质块模型、以合成材料为载体的模型适用于早期研究的快速评估和筛选，其结果具有片面性，不能直接应用或转化为临床方案，尚需在更加复杂、更具挑战性、更接近体内情况的模型中进一步验证。
未来的研究目标是构建出更接近体内、标准化、稳定可重复的根管多菌种生物膜模型，为根管感染控制研究搭建标准化平台。鉴于现实条件的局限性，多个模型与多种检测方法联合应用可以彼此互补，以期得到更全面、可靠的研究结果。
来源：鲍萍萍,邓嘉胤.根管生物膜体外模型研究进展[J].口腔医学研究,2024,40(02):108-112.
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