作者：李欢，陈伊，蒋祥龙，陈胜辉等，南昌市生殖医院

人类精子超低温冷冻技术作为辅助生殖技术的重要组成部分，其核心在于通过低温生物学原理将精子置于超低温环境（通常为-196℃）中保存[1]，使精子的代谢活动几乎完全停止[2]，从而实现长期保存而不丧失生理功能[3]。该技术始于20世纪中叶冷冻保护剂（如甘油）的发现[4]，解决了冷冻过程中冰晶损伤的核心难题，也是男性生育力保存的核心环节。传统冷冻保护剂依赖卵黄（egg yellow，EY）作为主要成分[5]，但其存在动物源性病原污染（如禽流感病毒）等问题，严重制约标准化临床应用[2]。HSPM（human sperm preservation medium）保护剂因含Hepes缓冲体系与蔗糖渗透压调节剂，在维持精子渗透压平衡方面表现优异，且不含动物源性制品，已成为新型冷冻体系的优选基础保护剂[6]。大豆卵磷脂（soybean lecithin，SL）作为植物源磷脂类物质，核心成分磷脂酰胆碱占比达60%以上，与EY中的功能性磷脂同源，且具有成分可控、无动物源性等优势[7]。磷脂酰胆碱修饰的冷冻液可使人类精子解冻后活力维持在40%以上，DNA碎片指数（DNA fragmentationindex，DFI）较传统EY制剂降低15%[8]。2024年Abdel-Ghani等[9]发现与传统20%EY的稀释液相比，低浓度SL纳米颗粒可提升公牛精子的平均路径速度（average path velocity，VAP）、曲线速度（curvilinearvelocity，VCL）等动力学参数达20%。本研究旨在探究HSPM配方中SL的最佳浓度，系统评估SL对精子活力、DNA完整性、形态、膜完整性的保护作用及对精子氧化应激水平的影响，比较SL与EY在正常精子和弱活力精子中的保护差异，为开发临床级别无动物源性冷冻保护剂提供实验依据。

1对象与方法

1.1研究对象

选取2024年1—12月南昌市生殖医院（我院）156例健康男性捐精者为研究对象。按第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[10]分为正常精子[前向运动（progressive motility，PR）≥32%，精子浓度≥15×106/mL，正常精子形态率≥4%，n=92]和弱活力精子（PR<32%，精子浓度≥15×106/mL，正常形态率≥4%，n=64）。志愿者在取精前禁欲3~7 d，手淫法取精，37℃液化30 min。纳入标准：年龄20~50岁；因不育症就诊；完成基本精液常规分析，浓度≥20×106/mL。排除标准：无精子症者；精液标本液化异常者；3个月内有发热史者。本研究已通过我院伦理委员会批准（[2023]087号），参与者均在取精前签署知情同意书。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂SL（货号：P5638，磷脂酰胆碱含量≥65%；Sigma公司，美国）；HSPM保护剂，参考文献[6]配制（Sigma公司，美国）；异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针（广州锐博生物技术有限公司）；DNA碎片检测试剂盒（浙江星博生物科技股份有限公司）。

1.2.2仪器计算机辅助精子分析仪（Minitube公司，德国）；荧光显微镜（型号Scope A1，ZEISS公司，德国）；流式细胞仪（型号DXFEX，贝克曼库尔特商贸有限公司，美国）；酶标仪（型号EXL-800型，美国

伯腾仪器有限公司）。

1.3精子冷冻与解冻

1.3.1精子冷冻液制备EY组（对照组）：HSPM保护剂+20%EY，搅拌均匀；SL组（实验组）：HSPM保护剂分别加入1%、2%、3%、5%SL，搅拌均匀。11.3.2精子冷冻与解冻步骤精液与冷冻液按3∶1体积比稀释，将标本与冷冻液充分混匀，室温平衡5 min。然后分装至1.5 mL冻存管，采用液氮蒸汽法进行冷冻，将细胞冻存管系于冻存管夹上，悬挂于液氮之上（刚刚离开液氮表面），放置30 min。随后将冻存管转移至液氮中，即将精液置于-196℃贮存。标本置于液氮中保存14 d，以备复苏使用。解冻步骤为将标本冻存管置于37℃水浴锅内，解冻5 min。

1.4检测项目及方法

①精子活力：采用计算机辅助精子分析仪检测精子活力，包括PR、总活力（totalsperm motility，TM）、VAP和VCL。②DNA完整性：吖啶橙法染色，流式细胞仪检测精子DFI，激发波长488 nm，发射波长530 nm。③形态学评估：巴氏染色后，在油镜下观察200个精子，计算正常精子形态率（头部、颈部、尾部均正常）。④膜完整性：质膜功能通过低渗肿胀试验（hypoosmotic swelling test，HOST），计数尾部卷曲精子占比；膜通透性通过FITC-PI双染，流式细胞仪检测活细胞率（FITC+PI-）。⑤氧化应激水平：DCFH-DA探针染色，酶标仪检测荧光强度[活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平]；比色法测量超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性与丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.5统计学方法

采用SPSS 27.0软件分析数据。正态分布的定量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本均数的t检验或单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法或Games-Howell法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1冷冻前精子浓度和精子活力比较

正常精子与弱活力精子的精子浓度、PR、VAP、VCL和TM比较，差异均有统计学意义（均P<0.001），见表1。

2.2各冷冻液组精子活力比较

在正常精子和弱活力精子中，各冷冻液组的PR、VAP、VCL和TM比差异均有统计学意义（均P<0.001）。其中，EY组与2%SL组精子活力参数最优，显著高于其余3组（均P<0.05）。EY组与2%SL组比较结果显示，在正常精子中，PR、VAP、TM差异无统计学意义（均P>0.05），VCL差异有统计学意义（P=0.044）；在弱活力精子中，PR和VAP差异无统计学意义（均P>0.05），VCL和TM差异有统计学意义（P值分别为0.007、0.014）。见表2。

2.3各冷冻液组DFI和正常精子形态率比较

在正常精子和弱活力精子中，各冷冻液组的DFI和正常精子形态率比较，差异均有统计学意义（均P<0.001）。其中，2%SL组DFI和正常精子形态率最优，DFI显著低于其他4组，正常精子形态率显著高于其他4组（均P<0.05）。见表3。

2.4各冷冻液组膜完整性和氧化应激水平比较

在正常精子和弱活力精子中，各冷冻液组膜完整性（HOST阳性率、活细胞率）和氧化应激水平（ROS、SOD、MDA水平）比较，差异均有统计学意义（均P<0.001）。其中，在膜完整性方面，EY组与2%SL组HOST阳性率和活细胞率最优，显著高于其他3组（均P<0.05），2%SL组与EY组差异无统计学意义（均P>0.05）。在氧化应激水平方面，2%SL组SOD显著高于其他4组，ROS和MDA显著低于其他4组（均P<0.05）。见表4、表5。

3讨论

3.1精子活力与膜完整性分析

据研究报道，SL中的磷脂酰胆碱能与精子质膜相互作用，通过整合入脂质双分子层来维持细胞膜在“冷冻-复苏”过程中的稳定性，从而降低冷冻造成的膜相变与脂质紊乱[9,11]。同时，SL作为两亲性分子，可有效减少冷冻保护剂的表面张力，进而抑制冰晶的异常生长与重结晶，从物理层面降低冰晶对精子细胞膜的机械损伤[12-13]。在本研究中，2%SL组的膜完整性与EY组相当，印证SL对精子质膜具备维护、修复作用。但在3%SL、5%SL组中，精子活力及膜完整性明显下降，其原因可能是SL浓度过高产生毒性，损伤精子细胞膜，进而影响精子活力。同时，本研究发现随着膜完整性的升高，精子活力也相应升高。综上分析，2%SL组、EY组在对精子活力和膜完整性上的保护效果显著优于其余3组。

3.2 DNA完整性与正常精子形态率分析

近年研究表明，SL在精液超低温冷冻保存体系中可作为EY的有效替代品，同时在精子复苏过程中可通过稳定精子膜结构来有效维持精子的正常形态，并展现出与EY相当的DNA保护效应[14-15]。本研究中，针对DFI及正常精子形态率，2%SL组显著优于EY组，更优于其余各SL组。这表明，2%的SL对精子DNA完整性及形态保护效果最佳。结合文献报道，SL可通过补充并稳定精子头部顶体区域的膜磷脂，显著提升解冻后精子的正常形态率与膜完整率[16-17]，为本研究中2%SL组在精子形态保护效果最佳的结论提供理论支撑。有研究通过对比不同精子优选方法，证实形态异常的精子DNA损伤程度也更高，直观展示DFI与正常精子形态率呈负相关[18]。本研究中正常精子与弱活力精子的正常形态率随着DFI的升高而降低，与上述报道一致。综合分析，2%的SL可维持精子头部顶体膜稳定性，提升正常精子形态率，同时可以很好地保护DNA完整性，这对精子受精能力的维持至关重要。

3.3氧化应激调控分析

本研究各冷冻液组中，2%SL组的ROS水平、MDA含量和SOD活性显著优于其余4组，2%SL组的ROS水平最低。既往研究提示，SL在精液冷冻保存体系中展现超越物理屏障功能的抗氧化特性，可通过调控氧化应激水平抑制脂质过氧化进程，从而降低MDA含量[19]，与本研究结果相呼应。有研究检测少弱畸形精子症患者精浆氧化应激指标，发现SOD活性越低，MDA水平越高，精子质量越差[20]，与本研究结果一致。另有研究表明，ROS与精子DNA完整性之间呈负相关关系，高水平的ROS通过诱导氧化应激直接导致精子DNA链断裂，增加DFI[21-22]。本研究也发现2%SL组的ROS水平最低，同时其对精子DNA完整性的保护效果最佳，以上研究报道为本研究提供理论支撑。综上分析，2%的SL在降低精子ROS水平、减少氧化应激对精子损伤上发挥重要作用，这对维持精子功能具有重要意义。

3.4浓度效应与临床适配性

本研究通过系统评估不同浓度SL对精子冷冻保存效果的影响，发现其存在明确的浓度效应，其中2%的SL表现出最佳的临床适配性。具体而言，该浓度下的精子在冻融后呈现出优异的精子活力，膜完整性也得到有效的维持，从而保障了精子正常的形态结构。在抗氧化方面，2%的SL能有效抑制ROS的过量生成，减轻脂质过氧化损伤，这直接体现在精子DFI的显著降低，进而最大程度地保护遗传物质的完整性。因此，2%SL的冷冻保护剂通过在精子活力、形态、膜完整性、DNA完整性及ROS等多个关键指标上的综合优异表现，证实其能为精子提供全面保护，且成分明确、效果稳定，是一种可能适于临床推广应用的理想试剂。综上所述，本研究通过探究HSPM配方中SL的最佳应用浓度，证实2%的SL在维持精子活力、DNA完整性、正常形态及膜稳定性方面均能发挥有效保护作用，并降低氧化损伤。与EY相比，SL在正常精子及弱活力精子均展现出相当或更佳的保护效果。SL还具备成分明确、无动物源风险等优点，这为开发临床级无动物源性冷冻保护剂提供了扎实的依据。然而，本研究仍存在一定局限性，目前结论主要基于实验室层面的精子质量参数评估，其临床终点效应（如受精率、妊娠率）尚待通过更大规模的临床试验予以验证。此外，SL与其他抗氧化剂（如白藜芦醇[23]、绿茶提取物[24]）的协同保护机制仍有待更为深入地解析研究。

参考文献略。

来源：李欢,陈伊,蒋祥龙,等.大豆卵磷脂在人类精子超低温冷冻保存中的应用研究[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2026,45(01):6-10.

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