作者：李盼，文新，韩丹，穆欣等， 西安交通大学第一附属医院转化医学中心，西安交通大学第一附属医院皮肤科

白癜风是常见的色素障碍性皮肤病，人群患病 率约0. 1% ～ 2%［1］。多数学者认为白癜风是一种 多基因遗传的自身免疫性疾病［23］ 。白癜风皮损病 理表现为黑素细胞及黑素颗粒减少，促进黑素生成 的药物可能具有治疗作用。体内黑素生物合成过程 处于复杂的控制之下。其合成可由酶级联介导，如 酪氨酸酶( TYＲ) ，酪氨酸酶相关蛋白1( TＲP1) 和多 巴铬互变异构酶( DCT)［4］。酪氨酸酶家族基因受 小眼畸形相关转录因子( MITF) 转录调控［5］。 甘草酸苷( GＲ) 具有抗肿瘤、抗病毒、保肝、神 经保护作用、抗炎等多种药理活性。有研究表明甘 草酸苷可促进 B16 黑素瘤细胞的黑素含量的合 成［67］ 。近年来，复方甘草酸苷已广泛应用于皮肤 科，笔者实验室前期研究表明甘草酸苷联合 UVB 使 用能显著提高白癜风患者的治疗效果［8］。但是，甘 草酸苷是否能促进原代黑素细胞黑素合成尚不清 楚。本实验采用原代黑素细胞作为研究对象，观察 甘草酸苷对于其黑素合成的影响，结果报告如下。

1 材料和方法

1. 1 材料 皮肤标本:6 例包皮环切术的正常健康 人均为2018 年12 月本院泌尿外科门诊儿童，年龄 6 ～10 岁。

1. 2 主要试剂 甘草酸苷购于 Sigma 公司， CCK8 细胞增殖及毒性检测试剂盒购于南京凯基公司。 M254 培养基、生长因子添加剂( Human Melanocyte Growth Supplement， HMGS) ( Cascade Biologics TM， 美国) ，兔抗人酪氨酸酶( Tyr) 抗体， MITF 抗体购自 Abcam 公司，二甲基亚砜( DMSO) 和弗斯可林( Forskolin)购于 Sigma 公司。Dispase 酶购于 Ｒoche 公司。 cAMP 免疫分析试剂盒购自于 Ｒ＆D system 公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 原代黑素细胞培养 取 6 ～ 10 岁儿童包皮 环切术后的组织，在超净台内 75% 酒精浸泡 30 s， PBS 清洗3 遍，将组织修剪至肉眼见不到皮下结缔 组织后，再修剪为 0. 5 cm × 0. 5 cm 大小; 将修剪好 的组织置于 6 cm 培养皿中，置入含 1% 双抗的 0. 25% DispaseⅡ液，4 ℃消化 16 h; 分离表、真皮， 将表皮移入另一平皿中剪切为碎末，加入 0. 25%胰 蛋白酶约25 mL， 37 ℃孵育 30 min，每隔 5 ～10 min 涡旋震荡一次，待瓶内液体浑浊后加入等量含 10% 胎牛血清的1640 培养基终止消化; 200 目的细胞筛 网过滤组织，细胞悬液于1 500 r/min 离心5 min，弃 上清;用含1%HMGS 的 254 完全培养基悬浮细胞， 按( 4 ～6) ×105 /mL 密度接种于培养瓶中， 37 ℃、含 5%CO2培养箱培养， 24 h 后换液，之后每3 d 换液 1次;黑素细胞易被胰酶消化， 0. 125%胰酶消化 3 ～ 5 min，同时应用药物筛选法，在培养基中加入 100 μg/mL G418， 24 ～48 h 后换液，以此获得纯化的黑 素细胞，本研究使用的均为第3 ～ 8 代原代黑素 细胞。

1. 3. 2 CCK8 检测甘草酸苷对于黑素细胞的影响 黑素细胞活性检测按照凯基生物公司 CCK8 法细 胞增殖检测试剂盒说明书操作，具体如下:不同浓度 甘草酸苷作用24 h 后分别观察黑素细胞形态变化， 更换96 孔板内实验组、空白组、对照组中为 100 μL 完全培养基，每孔加入 10 μL 细胞增殖及毒性检测 溶液，在37 ℃条件下继续培养 1 ～ 2 h; 选择酶标仪 450 nm 波长下测量各孔 A 值，所有数据全部减掉空 白对照组对应值，计算黑素细胞活性 = ( 实验组值/ 对照组值) ×100%。

1. 3. 3 黑素含量测定 甘草酸苷作用黑素细胞72 h 后， 0. 125%胰酶消化黑素细胞，镜下计数，调整每 组细胞浓度相同， PBS 洗 2 次，尽量吸净上清液; 加 入100 μL 1 mol/L NaOH 溶液( 含 10% DMSO) ，悬 浮细胞;95 ℃恒温金属浴中放置1 h;酶标仪405 nm 下测定各孔吸光值。有研究表明，弗斯可林可以显 著增高细胞内的 cAMP 的水平促进黑素生成［9］，故 使用弗斯可林作为黑素生成实验的阳性对照。

1. 3. 4 免疫印迹实验 黑素细胞分别经过甘草酸 苷和弗斯可林按照相应的时间点处理后，加入细胞 裂解液提取总蛋白。等量的蛋白经过12% SDSPAGE 凝胶电泳，胶分离后使用 PVDF 膜转膜。5% 脱脂牛奶封闭 PVDF 膜 1 h，分别加入一抗 4 ℃过 夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶( HＲP) 偶联的二 抗，室温孵育2 h。洗膜后加入 ECL 试剂，使用 BioＲad 发光仪显色。β-actin 作为对照。

1. 3. 5 cAMP 含量免疫测定 黑素细胞cAMP 含量 检测按照 Ｒ＆D 公司检测试剂盒说明书操作，具体如 下:甘草酸苷作用黑素细胞24 h 后， 0. 125% 胰酶消 化， PBS 洗 1 次，收集细胞，黑素细胞裂解在0. 1 mol/L 盐酸中抑制磷酸二酯酶活性。取细胞裂解液 完全按试剂盒说明书进行实验。

1. 4 统计学处理 使用 GraphPad Prism 5. 0 软件， 结果以 x ± s 表示，组间比较使用单因素方差分析， 两组之间使用 t 检验进行组间比较。P ＜0. 05 为差 异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 确定甘草酸苷对于原代黑素细胞存活率的影 响 使用不同浓度的甘草酸苷处理原代黑素细胞 48 h， CCK8 结果显示，黑素细胞活性伴随甘草酸苷浓度的增加而降低。当甘 草酸苷浓度为低浓度 ( 0. 25、 0. 5 mmol/L) 时黑 素细胞活性与对照组比较 差 异 无 统 计 学 意 义， 1 mmol/L甘草酸苷处理时 黑素细胞活性显著下降 ( 51. 23 ± 4. 27) % ( F = 18. 33， P ＜ 0. 001)，见图 1。 最终选择 0. 5 mmol/L 甘草 酸苷进行后续相关实验。

2. 2 甘草酸苷促进黑素 细胞黑素生成 使用 0. 5 mmol/L 甘草酸苷和 40 μmol/L 弗斯可林分别处理 黑素细胞48 h，氢氧化钠裂 解法显示甘草酸苷处理组 和弗斯可林组相比于对照 组黑素含量水平明显上调 ( t = 15. 45，3. 507; P ＜ 0. 05) ，作为阳性对照的弗 斯可林组相比甘草酸苷组 黑素含量水平更高( t = 5. 381， P ＜ 0. 01) ，差异均 有统计学意义，见图2。

2. 3 甘草酸苷增强黑素细 胞酪氨酸酶和转录因子 MITF 活性 酪氨酸酶和转 录因子 MITF 在黑素合成 中起到关键作用，甘草酸苷 或弗斯可林处理 24 h 后免 疫印迹结果显示，与对照组相比，甘草酸苷组和弗斯 可林组酪氨酸酶水平增高( t = 14. 39， 15. 08; P ＜ 0. 001) ;转录因子 MITF 表达水平甘草酸苷组和弗 斯可林组也明显增高( t = 4. 456， 10. 3; P ＜ 0. 001) ， 差异均有统计学意义，见图3。

2. 4 甘草酸苷促进 CＲEB 蛋白的磷酸化并增强细 胞内 cAMP 的水平 CＲEB 及 cAMP 信号在黑素生 成中起到关键作用，用甘草酸苷处理黑素细胞30， 60， 120 min 后，CＲEB 磷酸化水平在甘草酸苷处理 30 min 后无显著变化， 60 min 表达水平显著增高， 120 min 达到最大( F = 673. 3， P ＜ 0. 001) 。甘草酸 苷处理24 h 后 cAMP 水平相对于对照组显著升高 ( t =21. 94，P ＜ 0. 001) ，弗斯可林处理组 cAMP 水 平也升高( t = 16. 54， P ＜ 0. 001) ，差异均有统计学
意义，见图4。

3 讨论

白癜风患者免疫功能紊乱，皮损中酪氨酸酶活 性减低或消失，导致黑素生成量进行性减少或消失， 从而引起局限性或泛发性色素脱失。目前国际上关 于甘草酸苷与黑素细胞的文献很少，仅见于 Lee 等［8］报道的甘草酸苷可以促进鼠 B16 淋巴瘤细胞 系的黑素生成。在本实验中，采用来源于人包皮组 织的原代黑素细胞，研究甘草酸苷的促黑素生成作 用，更有意义。 黑素在黑素细胞的黑素小体内合成后，被运输 至树突末端，而后进入与其相邻的角质形成细胞内， 在角质形成细胞内重新分布、降解，其合成及转运过 程受到许多体内外因素的共同影响。黑素的合成及 分泌代谢受到多种信号转导通路共同调控。蛋白激酶 A( PKA) 信号转导在黑色素着色中的作用也被证 实［10］。PKA 可以使 cAMP 应答原件结合蛋白 ( CＲEB) 家族的转录因子磷酸化， CＲEB 蛋白将启动 子中相同的 CＲE 序列的基因表达激活，从而与 MITF 启动子相连接后上调黑素的生成酶［11］。 在研究中，确定了甘草酸苷可以促进原代黑素 细胞的黑素合成，并阐明其促进黑素合成的机制。 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，不仅 决定黑素合成的速率，还是黑素细胞分化成熟的特 征性标志。调控酪氨酸酶活性可增加或阻止皮肤黑 素生成。本实验证明甘草酸苷可以促进酪氨酸酶的 活性从而促进黑素含量合成。由于 CCK8 实验显示 0. 5 mmol/L 甘草酸苷对正常人黑素细胞的增殖无 明显作用( P ＞0. 05) 。从而证明甘草酸苷不是通过 促进黑素细胞的增殖，而是通过增加酪氨酸酶的活 性，来促进黑色素的生成。 本实验进一步证明甘草酸苷可以促进 MITF 转 录因子的表达水平升高，由于 MITF 可以调控酪氨 酸酶合成，实验结果进一步从转录水平上解释了甘 草酸苷促进黑素细胞合成的原因。体内黑素细胞中 黑素的合成、分泌是一项复杂、精确调控的过程，有 多种信号转导途经的参与调控并相互关联，且此过 程受多种体内外刺激因素的影响。在黑素合成中， 腺苷酸环化酶/cAMP 依赖蛋白激酶通路通过调节 黑素合成中的多个环节来发挥作用。实验结果证 明，甘草酸苷通过影响此信号通路升高 cAMP 水平 来促进黑素生成。弗斯可林作为促进激活 cAMP 信 号通路的阳性对照，其作用效果要超过甘草酸苷。

综上，本研究在体外 证明了甘草酸苷能够促进 原代黑素细胞的黑素合 成。其机制为: 增强黑素 细胞络氨酸酶活性、升高 黑素合成关键转录因子的 表达水平和激活 cAMP 信 号途径等。这将为甘草酸 苷在临床上的应用提供很 好的实验研究基础。

参考文献略。

来源：李盼，文新，韩丹，穆欣等，甘草酸苷促进人原代黑素细胞黑素生成的作用[J],中国皮肤性病学杂志，2019,33（9）：1014-1016.

(本网站所有内容，凡注明来源为“医脉通”，版权均归医脉通所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：医脉通”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)