作者：彭靖斐，李点英，孟 涛，中国医科大学附属第一医院产科

子痫前期（PE）是以高血压和蛋白尿为主要表现的妊娠期特有疾病，是妊娠期的严重并发症，发病率为4%～8%，在我国仍然是导致母儿死亡的主要原因［1］。目前，PE的发病机制仍未阐明。最近在Meng等［2］和Liu等［3］的研究中报道，UL16结合蛋白1（ULBP1）在PE患者胎盘中高表达，并且在PE的发病机制中扮演一定的角色。来自Hedlund等［4］的研究报道，ULBP1可以在人类胎盘来源的外泌体膜上表达。外泌体是40～150nm大小的磷脂双分子层的细胞外囊泡［5］，富含内核体相关的标志蛋白，如CD63等，并且可以携带生物活性分子，如DNA、mRNA、蛋白质等［6］，其携带的内容物由其分泌细胞决定。目前，关于PE患者外周血外泌体中的生物活性分子的研究甚少，为此，本研究目的在于检测ULBP1在PE患者和正常孕妇外周血外泌体中的水平，旨在探讨ULBP1在PE患者外周血外泌体中的表达情况及临床意义。

01资料与方法

1.1    研究对象    收集中国医科大学附属第一医院产科2017年6月至2018年7月就诊的20例PE患者。纳入标准：按照《妇产科学》（第9版）中PE的诊断标准。排除标准：合并妊娠期糖尿病、慢性高血压、肾病、感染性疾病及其他妊娠合并症。NC组为同期20例健康孕妇。纳入标准：非PE患者，新入院孕妇。排除标准：同PE患者的排除标准。所有研究对象签署知情同意书，本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会审批通过。

两组均为初产妇、单胎，年龄、身高均符合正态分布。经统计，年龄、孕周、BMI差异均无统计学意义，血压、尿蛋白和新生儿体重差异具有统计学意义。见表1。

1.2    研究试剂    外泌体提取试剂盒ExoQuick Precipitation kit和Western blot抗体购自美国SBI公司，BCA蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天公司，Human ULBP-1免疫酶联吸附试验（ELISA kit）试剂盒购自加拿大BioAim Scientific Inc公司。

1.3    血液样本收集    抽取入组产妇静脉血5mL，4℃冰箱静置1h，3600r/min离心10min分离血清，移取血清于EP管中，冻存于-80℃冰箱备用。

1.4    外泌体的提取    取出冻存的血清标本，12 000r/min离心15min，移取上层液体，通过0.22μm一次性过滤器过滤，过滤后的血清与提取剂4∶1的比例混合，吹打混匀［5］；4℃冰箱静置30min；1500r/min离心5min，移去上层液体，留取EP管底的淡黄色沉淀；加入现配PBS液，吹打重悬；再加入现配裂解液（RIPA∶PSMF=100∶1），振荡混匀；12 000r/min离心5min，留取上层液体备用。

1.5    外泌体的鉴定

1.5.1    Western blot检测CD63    备用裂解液经蛋白定量后，进行电泳，具体步骤如下：marker加5μL，各样本加10μL；8%SDS-PAGE胶电泳分离，80v电压电泳，待蛋白marker至分离胶后，120v电泳，视蛋白条带而定停止电泳；电流200mA转膜；5%脱脂牛奶封闭1h，加入抗体anti-CD63（1∶1000稀释）4℃孵育过夜；加入二抗HRP（1∶20 000稀释）孵育1h，ECL显影。
1.5.2    透射电镜鉴定外泌体的形态    将存于-80℃的备用裂解液取出，室温下融化，移取15μL于铜网上静置1min，使用滤纸将铜网上外围的液体吸干，移加2%的醋酸双氧铀染色液室温下染色1min，将染色完成的样本于灯下烤10min，使用透射电镜观察、拍片。

1.6    ELISA检测ULBP1的水平    按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：准备样品及试剂；标准品按照16μg/L、6.4μg/L、2.56μg/L、1.02μg/L、0.41μg/L、0.16μg/L、0.07μg/L和0μg/L的浓度梯度制备；各加入100μL的标准品及样品置于相应的孔，封板膜密封室温下孵育2.5h；洗板5次；各加入100μL的检测抗体，封板膜密封室温下孵育1h；洗板5次；各加入100μL的HRP，封板膜密封室温下孵育45min；洗板5次；各加入100μL的TMB底物溶液，室温下避光孵育30min；各加入50μL的停止溶液，立即于450nm波长下读数。

1.7    统计学分析    应用SPSS 20.0软件和GraphPad Prism 5.0软件进行数据和作图分析。计量资料结果以均数±标准差表示，采用两样本t检验进行统计。ULBP1在两组样本外泌体中的表达量属于计量资料，独立设计样本，采用非参数Mann-Whitney U检验进行统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

02方法

2.1    外泌体的鉴定
2.1.1    Wester blot鉴定CD63    NC组和PE组外泌体标志蛋白CD63检测均阳性。见图1。

2.1.2    透射电镜鉴定外泌体的形态    电镜下可见外泌体呈圆形或椭圆性，典型的双层膜状结构。见图2。

2.2    ULBP1的表达水平    ULBP1在PE组的外周血外泌体中水平［（1.0500±0.5937）μg/L］高于NC组［（0.4875±0.4346）μg/L］，差异具有统计学意义（P=0.0013）。见图3。

03讨论

PE的发病机制目前概括而言，是在妊娠早期，滋养层细胞侵袭子宫肌层不足，造成子宫螺旋动脉重铸障碍，导致胎盘灌注不足，胎盘局部发生缺血、缺氧损伤，随后受损的胎盘使母-胎界面氧化应激增加，胎盘分泌大量的不良因子（如外泌体［7-10］）及细胞碎片进入母体循环，诱导母体发生过度的系统性炎症反应及血管内皮功能紊乱，临床上表现出疾病症状。子宫蜕膜自然杀伤细胞（uNK）在维持正常妊娠中起到一定的作用［4］，ULBP1是uNK细胞的一种自然杀伤细胞活化性受体凝集素样同型二聚体（NKG2D）配体（NKG2DL）的一个亚类，通过与相应受体结合，会影响uNK细胞的生物学功能。最近有研究报道，ULBP1在PE患者胎盘中表达上调进而影响PE的发生发展。在Meng等［2］的研究中使用基因芯片以及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术发现ULBP1在PE孕妇胎盘中较正常产妇胎盘中高表达。同样在Liu等［3］的研究中，使用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术验证ULBP1的mRNA，及使用Western blot技术验证ULBP1蛋白，均在PE患者的胎盘中高表达，上调的ULBP1通过下调NKG2D，进一步影响了uNK细胞分泌相关的细胞因子含量，其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）［11］，干扰素-γ（IFN-γ）［12］，转化生长因子-β1（TGF-β1）［13］均抑制滋养层细胞侵袭，白细胞介素-6（IL-6）［14］和白细胞介素-8（IL-8）［15］促进滋养层细胞侵袭，而这些细胞因子的表达失衡可能影响了妊娠早期滋养层细胞的侵袭状态，进而导致PE的发生发展。胎盘产生的外泌体主要来源于滋养层细胞［4］，通过细胞出芽方式主动分泌到细胞外环境，在Hedlund等［4］的研究中报道，人类胎盘释放的外泌体膜上可以表达ULBP1，并且有研究表明，孕妇的胎盘组织产生的外泌体通过肺循环进入到外周循环中［16］，而在妊娠第6周就能在孕妇外周血中检测到胎盘来源的外泌体［17］，并且PE患者的外泌体数量显著高于正常孕妇［18］。本研究中我们通过ELISA法检测了PE患者外周血外泌体中ULBP1的水平，发现其明显升高，因此，我们猜测PE患者的胎盘由于缺血缺氧等应激性状态导致释放表达ULBP1的外泌体增加，并且进入到外周血循环中表现出其水平上的变化［7-10］。

综上所述，PE患者外周血外泌体中ULBP1水平升高，可能会为PE的诊治提供一定依据。但本研究的样本取材于妊娠晚期，在发生PE之前其表达量是否已经发生变化不得而知，今后可以探索外周血外泌体中ULBP1的水平是否在PE患者的早、中孕期就发生了变化。

参考文献 略

来源：彭靖斐，李点英，孟 涛，UL16结合蛋白1在子痫前期孕妇外周血外泌体中表达的分析[J],中国实用妇科与产科杂志，2019，35（8）。

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