转移仍是癌症的一个常见特征，也是大多数癌症相关死亡的原因。尽管已知原发性肿瘤每天会向循环系统中释放数千个细胞，但仅有少数细胞能够存活并形成转移灶，这表明归巢至远处部位并进行定植是转移级联反应中的主要瓶颈。成功的转移定植需要克服来自外界敌对微环境的限制，尤其是免疫监视。播散性肿瘤细胞（DTCs）可被宿主免疫细胞（主要是CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞[NK细胞]）识别并清除。然而，与原发性肿瘤生长过程中的免疫编辑相比，人们对于外渗的肿瘤细胞在转移定植和生长期间与局部免疫细胞之间的相互作用了解甚少。

本研究分别在免疫系统完整与T细胞缺陷的情况下，利用小鼠肝癌转移模型进行体内CRISPR文库筛选，使用一个定制的单向导RNA（sgRNA）文库，该文库包含人类癌症中频繁突变的基因，鉴定出了在转移定植过程中对肿瘤免疫逃逸至关重要的基因，并采用多种实验方法深入探究了其内在作用机制。

1. T细胞限制DTCs的肺转移

研究人员静脉注射不同数量Hepa1-6小鼠肝癌细胞建立癌症转移免疫监视模型，并通过活体显微CT（Micro-CT）监测肺转移。结果显示：C57BL/6J小鼠注射少于400万个细胞时无法形成肺转移灶，而所有注射200万个细胞的T细胞缺陷型BALB/c裸鼠均发生肺转移。通过中和抗体构建T细胞剔除模型证实，剔除CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞后，C57BL/6J小鼠肺转移得以重现，表明T细胞免疫对Hepa1-6细胞转移定植具有关键限制作用。流式细胞术分析显示，与C57BL/6J小鼠的正常肺组织相比，转移瘤中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、调节性T细胞（FoxP3⁺ CD4⁺）及耗竭性（PD-1⁺）CD8⁺ T细胞数量显著增加。

2. 免疫应激下转移抑制因子的体内CRISPR筛选

基于该肺转移小鼠模型，通过CRISPR文库筛选鉴定调控DTCs免疫逃逸的关键基因。初步全基因组筛选（覆盖19,674个基因）显示：在T细胞缺陷小鼠中成功诱导转移，但在免疫健全小鼠中未发现显著富集的基因突变，提示在免疫压力下难以筛选到转移驱动基因。为提高筛选效率，进而构建了靶向161个癌症相关基因的定制文库（mDriverV1）。注射mDriverV1感染的Hepa1-6细胞后，33%的免疫健全小鼠形成肺转移灶（n=50），而对照组无转移发生，证明该策略可有效识别在免疫压力下促进转移定植的关键基因。

3. Sgk1缺失通过逃逸T细胞介导的清除驱动转移

通过对野生型（WT）和T细胞缺失小鼠的肿瘤转移灶进行扩增子测序，并设定sgRNA丰度、多条独立sgRNA靶向及跨小鼠重复性三重标准筛选候选基因。最终鉴定出共有15个基因（被39条sgRNA靶向）在WT小鼠中富集，9个基因（被32条sgRNA靶向）在T细胞剔除小鼠中富集，其中Sgk1在WT小鼠中评分最高。SGK1是一种在细胞应激中发挥重要作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。通过CRISPR技术成功构建了Sgk1-KO的Hepa1-6细胞系并验证其敲除效率，功能验证显示：在免疫健全小鼠中，Sgk1-KO细胞能形成肺转移灶，而对照组不能；反之，在Sgk1低表达的MC38结肠癌细胞中过表达Sgk1则显著抑制其肺转移能力。在T细胞缺失的情况下，注射Sgk1-OE或Vector细胞的小鼠所形成的肺转移灶数量无显著差异，表明Sgk1通过调控肿瘤细胞对T细胞介导清除的敏感性来抑制转移定植。

4. SGK1在转移灶中表达降低并与不良预后相关

临床分析表明，SGK1在肝癌肺转移灶中的mRNA和蛋白表达均显著低于对应的原发灶，该现象在结直肠癌肝转移、转移性乳腺癌和胰腺导管癌中同样存在。单细胞测序显示循环肿瘤细胞中SGK1表达亦降低。同时，SGK1高表达与细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润减少、T细胞耗竭比例升高相关。对116例肝癌患者随访发现，原发性肿瘤SGK1低表达预示着更短的总生存期和更高的肝外转移风险，经过多因素分析确认其是独立预后因素，TCGA数据进一步验证Sgk1的预后价值适用于多种癌种。

5. 肿瘤细胞中Sgk1的缺失通过干扰TNF-α和IFN-γ信号传导减轻CD8⁺ T细胞介导的杀伤

敲除Sgk1不影响肿瘤细胞增殖能力，但显著增强其对CD8⁺ T细胞杀伤的抵抗。这种抵抗作用具有细胞自主性，且依赖于Sgk1的激酶活性——回补野生型Sgk1可恢复敏感性，而激酶失活突变体（S422A）则无效。转录组分析显示，Sgk1缺失或激酶活性丧失会特异性抑制由CD8⁺ T细胞激活的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/核因子κB(NF-κB)和干扰素-γ（IFN-γ）信号通路。机制研究表明，Sgk1通过其激酶活性调控T细胞来源的TNF-α/IFN-γ所介导的杀伤作用：细胞因子刺激可增强其底物NDRG1的磷酸化，而激酶失活型SGK1无法介导此过程，且使细胞对细胞因子杀伤产生抵抗。这些发现证明，Sgk1通过调控TNF-α/IFN-γ信号通路，直接影响肿瘤细胞对CD8⁺ T细胞杀伤的敏感性，其激酶活性是介导该作用的关键分子基础。

6. SGK1激酶活性缺失减弱RIPK1介导的细胞死亡

Sgk1缺失显著降低了死亡受体介导的RIPK1磷酸化激活，同时Sgk1与RIPK1存在直接相互作用。功能实验表明，SGK1缺失或RIPK1抑制均能显著减弱TNF-α诱导的细胞死亡，且同时敲除SGK1与RIPK1不再产生叠加效应。转录组分析显示，SGK1通过调控RIPK1依赖性基因网络影响IFN-γ应答和TNF-α信号通路。这些结果证明SGK1通过与RIPK1相互作用并调控其磷酸化，从而介导CD8⁺ T细胞诱导的细胞程序性坏死。

7. SGK1-KO转移性生长将微环境重塑为终末耗竭状态

SGK1缺陷肿瘤细胞通过重塑免疫微环境实现免疫逃逸。单细胞RNA测序显示，与对照组相比，Sgk1-KO转移灶中T细胞比例显著降低，且CD8⁺ T细胞呈现明显的耗竭特征：高表达Lag3、Ctla4、Pdcd1等耗竭标志物，而细胞毒性特征（Gzmk、Prf1、Nkg7）显著减弱。拟时序分析可知，Sgk1-KO转移灶中的CD8⁺ T细胞主要处于终末耗竭状态，而对照组则多为祖细胞耗竭状态。这一发现通过流式细胞术得到验证，证实Sgk1-KO转移灶中PD-1⁺TIM-3⁺CD8⁺ T细胞显著富集。综上可知，SGK1缺失通过诱导CD8⁺ T细胞终末耗竭，塑造了有利于肿瘤免疫逃逸的微环境。

8. Sgk1-KO转移灶对治疗性免疫治疗不敏感但对预防性免疫治疗敏感

Sgk1-KO转移灶对免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗响应取决于干预时机。在模拟临床治疗（肿瘤注射后3周开始给药）时，抗PD-1/LAG-3抗体对Sgk1-KO转移灶无效，但对对照组有效。证明Sgk1缺失的转移灶对ICIs抵抗，而表达Sgk1的转移灶对治疗性免疫治疗有反应。而预防性干预（接种当天给药）能显著抑制Sgk1-KO细胞转移，抗PD-1抗体甚至可实现肿瘤完全消退。这一现象在H22和Hep53.4细胞系中得到验证。机制分析表明，Sgk1沉默的转移肿瘤对治疗性ICI无效可能与病灶中富集终末耗竭CD8⁺ T细胞有关，而早期干预可有效阻断转移定植。

9. SGK1是转移性HCC患者对ICI应答的预测因子

对11例接受抗PD-1治疗的肝癌肺转移患者分析显示，治疗应答组的肿瘤组织SGK1表达水平显著高于无应答组，表明SGK1可作为预测免疫检查点抑制剂疗效的潜在生物标志物。

本研究揭示体内CRISPR筛选鉴定出Sgk1是抑制肝癌转移定植的关键因子，Sgk1缺失会抑制CD8⁺ T细胞诱导的RIPK1依赖性坏死性凋亡，赋予转移性肿瘤细胞生存优势。Sgk1沉默的转移瘤生长促进终末耗竭CD8⁺ T细胞的浸润，形成免疫抑制微环境。而这种情况可在肿瘤细胞转移定植早期阶段施用ICIs来逆转，而晚期治疗性干预则因微环境不可逆而失效。临床分析证实，Sgk1低表达与患者预后不良相关，且其表达水平可作为预测免疫检查点抑制剂疗效的可靠生物标志物。该研究不仅阐明了Sgk1调控肿瘤免疫逃逸的新机制，还为针对癌症转移中T细胞免疫抵抗的潜在治疗策略提供了宝贵见解。