作者：山东第一医科大学附属省立医院骨肿瘤科     刘荣兴

骨肉瘤是儿童与青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,起源于骨间充质细胞,好发于长骨干骺端。骨肉瘤具有高度侵袭性和转移倾向,尤其是肺部转移,全世界每100万人发病3人,占原发骨肿瘤的11.7%。近年来,尽管传统治疗取得了进展,5年生存率升至70%,但对于治疗反应不佳或有转移的患者,5年存活率仅20%~30%,因此亟需探索新的治疗靶点。

Cx43是骨中表达的连接蛋白(Cx)家族中最丰富的成员,由间隙连接蛋白α1基因编码,在所有骨细胞类型的mRNA和蛋白质水平上都有表达。而Cx构成的细胞间间隙连接是相邻细胞间进行信息传递的一种膜通道结构,可以进行骨组织细胞间物质及信号传导通讯,在维持骨代谢平衡中起重要调控作用。此外,间隙连接可以在相邻细胞之间创建独特的间隙连接细胞间通讯(GJIC)网络,此网络在各类细胞生长、分化以及迁移等生理、病理过程中具有重要作用。目前,已有不少研究表明Cx43与骨肉瘤发生发展具有密切联系,是骨肉瘤治疗的潜在靶点之一。

Cx43的生理功能及相关机制

Cx43不仅参与GJIC网络的形成,而且与维持骨组织细胞间平衡及结构稳定密切相关。赵鑫等发现过表达Cx43能够促进成骨细胞的增殖和成骨分化,并推测其调控机制可能通过细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2通路实现。此外,他们还发现地塞米松作用下成骨细胞的增殖和成骨分化能力明显下降,且细胞中Cx43表达下降。这进一步反映出Cx43与成骨细胞的增殖与分化密切相关。

Cx43维持骨组织细胞间的平衡     Cx43可以通过调控成骨特异性转录因子的表达,促进成骨前体细胞向成熟成骨细胞的分化。例如,Li等通过多组对照发现间隙连接蛋白Cx43作为骨细胞上的力学感应受体,能通过影响成骨、破骨活动对骨改建发挥重要的调节作用。此外,Cx43所形成的间隙连接比Cx45更易让带负电的染料通过,这一差异对成骨细胞的通讯和分化至关重要。在主要表达Cx43的细胞中,降低Cx45的表达会显著抑制染料的转移,并减少骨基质相关蛋白的表达;而在主要表达Cx45的细胞中,增加Cx43的表达则能增强细胞间的耦合并促进上述蛋白的表达。因此,通过调节Cx43的表达水平,能够明显改变间隙连接的通透性,从而影响成骨细胞特异性基因的转录,并维持分化后的成骨细胞表型和GJIC网络。

Cx43促进骨结构稳定     研究表明,Cx43在骨骼系统中广泛分布,并在成骨细胞中发挥着至关重要的作用。在成骨细胞的Ca2+波传递过程中,主要表达Cx43的大鼠骨肉瘤细胞(UMR-106)能够通过间隙连接传递缓慢的Ca2+波,且这一过程独立于胞内钙储存的释放。而转染实验进一步证实,Cx43的表达赋予了UMR-106缓慢传导Ca2+波的能力。除了Ca2+信号外,环磷酸腺苷(cAMP)在成骨细胞的信号转导和功能调控中也扮演着重要角色。前者的传播模式因细胞间的Cx类型和环境而异,而cAMP的细胞间共享则在基因表达和信号调控中起着关键作用。研究发现,Cx43通过介导cAMP的细胞间共享,显著增强了成骨细胞的信号传导和基因表达调控。在小鼠前成骨细胞系和低分化UMR-106中,Cx43的过表达能够促进cAMP响应元件结合蛋白以及细胞外信号调节激酶的磷酸化水平。重要的是,这一效应来源于cAMP的细胞间共享,而非其生成量的增加。进一步的研究表明,Cx43还能通过cAMP依赖的方式促进核因子配体mRNA的表达,并抑制硬化蛋白mRNA的表达,从而影响骨组织的重塑。此外,Cx43的通讯功能还受部分激素影响。例如,甲状旁腺激素(PTH)在大鼠颅骨成骨细胞(ROB)中通过cAMP依赖性通路,以浓度依赖的方式显著增强了细胞间的通讯功能。然而,在UMR-106等其他细胞系中未观察到类似的效果。这一差异可能与Cx43的表达水平以及细胞环境密切相关,ROB和UMR-106细胞中Cx43的表达较高,而其他细胞系中的Cx43表达较低。

Cx43在骨肉瘤细胞中的异常表达

Cx43在骨肉瘤细胞中的表达与正常细胞中存在多方面的显著差异。首先,Cx43在骨肉瘤中表达降低,且恶性程度越高,其表达水平越低;其次,在正常骨组织中,Cx43主要定位于细胞间膜,但在骨肿瘤中定位发生异常,除细胞间膜外还异常分布于细胞质中。由于在正常骨组织和肿瘤性骨组织中Cx43的mRNA表达水平相似,目前广泛认为这种亚细胞定位的改变可能削弱了肿瘤组织中通过间隙连接介导的GJIC功能。此外,Talbot等认为,Cx43的表达水平在肿瘤发展中呈现双重作用:低水平的Cx43可能促进肿瘤的增殖和发生,而高水平的Cx43则可能增强肿瘤的转移和播散。但Cx43无论作为肿瘤抑制因子还是作为肿瘤促进因子,都在骨肉瘤的发展中起拮抗作用。为了进一步探讨Cx43表达异常的原因,不少学者已对其调控机制展开了深入研究。同时,通过杆状病毒表达-脂质体融合技术制备的含Cx43的巨脂质体,为膜通道蛋白的研究及其应用提供了新工具。

转录及表观遗传调控    研究表明,Cx43通过影响细胞周期调控机制来抑制细胞的增殖。过表达Cx43能够上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的蛋白水平,通过积累低磷酸化Rb蛋白以及降低细胞周期蛋白激酶活性,进一步抑制细胞周期的推进,从而阻止细胞从G1期向S期的转变。这一作用依赖于Cx43介导的间隙连接功能,并与cAMP信号传导通路的激活密切相关。另一方面,Pendleton等发现与前成骨细胞相比,在视网膜母细胞瘤基因(Rb1)敲低的小鼠成骨细胞中,GJIC功能减弱,同时介导GJIC的蛋白Cx43表达也相应减少。这说明Rb1的功能丧失会显著抑制Cx43表达及间隙连接介导的GJIC功能。此外,该细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达显著增加,虽然降低PPAR-γ可以改善成骨细胞基因的表达,但对Cx43的表达及GJIC功能无显著影响。这提示Rb1丢失引发的GJIC功能抑制可能与PPAR-γ的上调无直接关联,且GJIC功能的恢复需要针对Cx43进行直接调控。通过大规模的基因表达数据分析,有研究者发现Cx43在骨肉瘤细胞分化过程中上调,在转染miR-23a的细胞中下调。充分证明Cx43是对成骨细胞发育至关重要的细胞间信号传导介质,并受miR-23a水平的急性影响。同时,使用萤光素酶报告分析在体外证实了miR-23a可以抑制Cx43mRNA的表达,进一步揭示了骨肉瘤中microRNA表达、细胞间信号传导和骨分化之间新的相互作用。此外,Chen等认为T-box转录因子2(Tbx2)作为骨发育相关的重要转录因子,可通过结合Cx43启动子中的T盒基序,直接抑制其转录表达。同时在骨肉瘤细胞中,下调Tbx2能够解除对Cx43的抑制作用,从而增强GJIC功能。

蛋白降解与翻译后修饰     除了基因调控的方式外,研究者发现,炎症因子如肿瘤坏死因子-α及其相关的凋亡诱导配体也可调节成骨细胞中的Cx43蛋白水平。这些炎症因子通过激活溶酶体蛋白酶的活性、将Cx43蛋白从细胞突起中选择性移除以及激活Cx43的结合伴侣等途径,能够显著降低成骨细胞中的Cx43蛋白水平。这不仅揭示了炎症因子通过多层次调控影响Cx43蛋白降解及其功能的深远机制,而且为进一步理解Cx43在细胞间通讯和信号传递中的作用提供了重要依据。

此外,翻译后修饰也会影响Cx43的表达。Mickus等总结出间隙连接电导的主要调节因子是连接电压、细胞内pH、Ca2+、Mg2+和磷酸化。其中通过磷酸化Cx43羧基末端可以变构调节Cx的效力。而左夏林等进一步揭示羧基末端富含的丝氨酸和脯氨酸是Cx43磷酸化修饰的潜在靶点,亦是蛋白相互作用的结构域。Cx43羧基末端的磷酸化修饰调控着Cx43的转运、间隙连接的组装和降解、间隙连接通道的门控,对于调控神经系统GJIC的功能至关重要。同样,Cx43受小泛素样修饰物(SUMO)的调节。骨肉瘤中SUMO结合酶Ubc9蛋白过表达,而通过siRNA沉默Ubc9可以抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移,并在体外和体内显著增加细胞对单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统的敏感性。进一步的实验表明,沉默Ubc9可以诱导SUMO1与Cx43的解耦,增加游离Cx43水平,不仅能够重建GJIC,而且对恢复细胞功能非常重要。

信号通路调控    信号通路在调控Cx43表达中起关键作用,其中多种激素通路尤为重要。马义博等发现小鼠肾脏缺血再灌注损伤显著上调了肾小管上皮细胞中Cx43的蛋白表达,而在损伤前给予雌激素预处理可以显著逆转Cx43蛋白的异常高表达,同时有效减轻了肾功能指标的恶化及组织病理损伤。除雌激素外,PTH是Cx43的另一重要调节激素。研究表明,PTH通过作用于Cx43启动子增加间隙连接蛋白α1转录速率,能显著提高Cx43表达,且此效应与成骨细胞分化状态密切相关。此外,PTH还可作用于3’UTR特定区域,在转录后水平调控表达。同时体内实验证实PTH可诱导转基因小鼠胫骨骨细胞Cx43表达。值得注意的是,在UMR-106等成骨细胞系中,PTH及其下游信使cAMP能以浓度和时间依赖的方式显著增强Cx43mRNA表达,表明cAMP通路同样参与调控成骨细胞Cx43表达及间隙连接功能。其他信号通路也与Cx43调控及骨肉瘤进展相关。Harris等发现,肝配蛋白A型受体2(EphA2)在多数骨肉瘤细胞系中过表达,其沉默显著降低细胞存活、迁移和侵袭能力,提示抑制EphA2可削弱骨肉瘤肿瘤发展能力。这些效应可能由原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、蛋白激酶B及细胞外信号调节激酶-丝裂原活化蛋白激酶等信号通路介导。此外,沉默EphA2还增强了骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性,提升了化疗效果。

Cx43在药物治疗中的应用

骨肉瘤是一种高度侵袭性的恶性肿瘤,传统治疗方法的疗效受限,主要由于其对化疗的耐受性较低且副作用较为显著。此外,手术治疗后包括感染、假体脱位在内的并发症发生后,患者需经过多次清创、换药或复位、二次手术等,影响患者的身心健康,增加治疗成本。因此,探索新的治疗策略对于改善骨肉瘤预后具有重要意义。近年研究表明,GJIC在维持体内平衡及抑制细胞恶性转化中发挥关键作用。作为GJIC的主要组成成分,Cx43被视为抗肿瘤治疗的重要潜在靶点。其作用体现在多个方面:Cx43可降低食管癌对化疗的耐药性;还可以通过增强胶质瘤细胞对单纯疱疹病毒胸苷激酶或更昔洛韦自杀基因治疗的敏感性,促进胶质瘤细胞凋亡。此外,Cx43在结肠癌、直肠癌、膀胱癌、转移性乳腺癌及骨肉瘤等多种癌症的治疗中均可作为治疗靶点,尤其在骨肉瘤治疗领域展现出巨大潜力。同时,某些中药活性成分也能够调节Cx43的表达,并在骨肉瘤治疗中发挥重要作用。例如,丹参酮ⅡA可以通过激活PKC调控Cx43表达和磷酸化。而白藜芦醇通过上调Cx43的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭,并诱导其凋亡,进一步强化了Cx43作为治疗靶点的潜力。

除了中药外,免疫疗法也是重要的治疗方向。Riquelme等开发的半通道激活抗体Cx43-M2,不但直接靶向原位骨细胞,激活骨细胞半通道并升高细胞外腺嘌呤核苷三磷酸(ATP),显著抑制骨肉瘤生长转移及骨溶解;同时,该抗体还可通过促进效应T淋巴细胞的数量和活化增强抗肿瘤免疫,促进ATP释放和嘌呤能信号传导,重塑抑制性肿瘤微环境,凸显了Cx43-M2治疗骨肉瘤的潜力。

Shen等设计的Cx43激动型单克隆抗体ALMB-0168是一种新型Cx43半通道激动剂单克隆抗体,通过特异性激活骨细胞上的Cx43半通道,从而释放ATP等抗癌因子到细胞外环境中,调节肿瘤微环境,在临床前研究中显示出抑制骨肉瘤生长和迁移的作用。其研究在14例患者(10例男性,4例女性)中完成了6个剂量水平(1~24mg/kg)的测试,试验中并未观察到Cx43相关的心脏事件或严重的肝脏事件以及剂量限制毒性,表明ALMB-0168在疗效显著的同时兼具良好耐受性,为标准化疗后的转移性或不可切除骨肉瘤的治疗提供了切实可行的新思路。

针对术后肿瘤复发和伤口愈合延迟的难题,He等开发了一种新型双功能可注射水凝胶系统。其核心是一种双功能Cx43模拟肽———近膜2(JM2),它被接枝到透明质酸上形成均质材料。JM2能有效抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,从而在体内外抑制肿瘤生长。与此同时,JM2还能通过调控修复细胞的ATP释放,创造有利的炎症微环境并促进血管生成,从而加速全层皮肤缺损的愈合。该水凝胶在肿瘤切除后的缺损中能同时实现抑制肿瘤复发和促进伤口愈合的双重效果,展现出巨大的术后治疗应用潜力。

挑战与未来展望

综上所述,Cx43在骨肉瘤的发生与发展中起着重要作用,并且针对Cx43的多种靶向策略为骨肉瘤治疗提供了创新方向,包括调控Cx43表达、增强GJIC以及联合治疗等方法。然而,目前对Cx43在骨肉瘤中的研究仍有不足,且其临床应用尚处于探索阶段,并不像在肾透明细胞癌、结肠癌等多种肿瘤中的研究较完善。此外,由于Cx43在多种细胞中广泛表达,靶向Cx43的治疗策略可能存在特异性不足的问题。尽管如此,现有研究为开发更高效的骨肉瘤治疗方案奠定了坚实基础,并展现了Cx43作为骨肉瘤潜在治疗靶点的广阔前景。

值得注意的是,下一代测序(NGS)技术通过解析骨肉瘤的基因组、转录组和表观遗传信息,深刻变革了其研究与临床管理。NGS技术能够鉴定驱动突变、基因融合及表观遗传改变,为精准诊断、预后评估及靶向治疗开发提供关键依据,并借助液体活检实现早期监测。尽管面临技术、数据解读和成本等挑战,但未来的技术迭代、多组学整合及临床试验验证,将推动骨癌治疗向更个性化和有效的方向发展。因此,是否可以通过检测间隙连接蛋白α1来评估骨肉瘤的发生风险,并进一步实现其早期诊断与干预,是当前亟待解决的重要问题,也是本团队接下来的研究重点。

来源：实用骨科杂志2026年2月第32卷第2期

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