作者：武汉大学人民医院运动医学与关节外科      吴子煜

骨关节炎（OA）是最为常见的慢性肌肉骨骼疾病之一，主要累及具有典型衰老特征的中老年人群。目前，OA已成为导致老年人群残疾的主要原因，构成了全球重大的社会医学挑战。其病因复杂，且常与多种代谢性疾病共病，这既增加了治疗的复杂性，也限制了对特定患者群体的治疗方案选择。迄今为止，尚未确立明确的OA预防或根治策略：药物治疗大多仅具姑息性，以缓解症状为主；而外科干预则存在固有风险，包括术后翻修及一系列潜在并发症。因此，阐明OA的发病机制并探寻更有效的治疗手段，具有重要的医学及社会经济意义。软骨细胞作为软骨组织的主要细胞成分，在OA的进展中处于核心地位，其退变与丢失是OA发病的关键驱动因素。先前研究已强调，异常的软骨细胞凋亡与坏死在OA的发生与发展中起关键作用，且有证据表明抑制这些过程可改善OA的临床结局。铁死亡是近年发现的一种程序性细胞死亡形式，有别于传统的凋亡与坏死，其特征为铁依赖性和细胞磷脂的氧化损伤。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡通路的关键调控因子。重要的是，GPX4的合成与谷胱甘肽（GSH）的产生密切相关，而GSH是细胞抵御铁死亡的关键防御机制。

关于铁超载的实验研究表明，软骨及滑膜组织中过度的细胞内铁积聚会导致铁转运蛋白、促炎细胞因子及软骨基质重塑的失调，这些均被认为是OA发病早期阶段的关键促进因素。探究铁死亡的调控机制，可为深入理解OA的病理生理机制提供新视角，并可能为开发创新治疗策略开辟新途径。在过去的数十年间，电磁场的治疗潜力在多种疾病中受到广泛关注。在各种类型电磁场中，脉冲电磁场（PEMF）因其无创性及深入组织的能力而日益受到重视。PEMF的特征在于具有特定波形和振幅的低频磁场，频率通常在6~500Hz，并以极短的脉冲间隔施加。研究表明，优化PEMF的物理参数（如频率、强度、持续时间和波形）可获得良好的治疗效果。初步研究提示，PEMF可能影响OA的进程。当前研究多聚焦于PEMF对炎症、代谢通路（如糖酵解）或干细胞分化的调控，而PEMF是否通过调节铁代谢、脂质过氧化或抗氧化通路干预软骨细胞铁死亡，仍属未知领域。本研究旨在进一步探讨脉冲电磁场对OA及软骨细胞铁死亡的作用，以填补该领域的认知空白。

材料与方法

试剂与仪器     重组人白细胞介素-1β（IL⁃1β）购自MedChem⁃Express（美国，新泽西）。ELISA试剂盒购自R&DSystems（美国，明尼苏达）。Griess试剂购自碧云天（中国，上海）。丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（中国，南京）。基质金属蛋白酶（MMP）、核因子κB（NF⁃κB）、GPX4及核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路相关抗体由武汉爱博泰克生物科技有限公司（中国，武汉）提供。PEMF发生线圈PMC⁃3000D购自苏州峰极电磁科技有限公司（中国，苏州）。双人超净台（SWCJ2F）购自上海沪净医疗器械有限公司（中国，上海）。台式离心机（160C）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（中国，上海）。SDS⁃PAGE电泳槽及转印槽、电泳电源（DYY⁃7C）和移液器（10μL、200μL、1mL）购自武汉塞维尔生物科技有限公司（中国，武汉）。倒置荧光显微镜（IX51）购自日本奥林巴斯株式会社（日本，东京）。酶标仪购自珀金埃尔默公司（中国，上海）。

细胞分离与处理     在无菌条件下，使用骨剪取出大鼠膝关节，置于无菌培养皿中。清除周围滑膜组织并冲洗关节后，使用手术刀片去除表层关节软骨，并用眼科剪将其剪成均匀小块。软骨碎片置于37℃胰蛋白酶溶液中消化30min。弃去上清，使用D⁃Hanks溶液洗涤组织三次。随后加入5mL0.2%Ⅱ型胶原酶进行完全消化过夜。将细胞悬液转移至15mL离心管，以1500r/min的转速离心5min，获得原代软骨细胞。使用D⁃Hanks溶液洗涤细胞，过滤后转移至无菌培养瓶。在5%CO2、37℃条件下，使用含10%胎牛血清及100U/mL青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基培养细胞。

CCK⁃8法检测细胞活力      将软骨细胞接种于96孔板，分为四组，分别接受不同处理：对照组，常规培养、不加任何处理；IL⁃1β组，10ng/mLIL⁃1β诱导24h；PEMF组，脉冲电磁场（75Hz，1.5mT）暴露24h；PEMF+IL⁃1β组，10ng/mLIL⁃1β联合PEMF（75Hz，1.5mT）同时处理24h。处理后，按照说明书每孔加入10μLCCK⁃8溶液。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度以评估细胞活力。

前列腺素E2、MMP及NO的测定     使用ELISA试剂盒按照说明书分别检测软骨细胞及OA大鼠模型中前列腺素E2（PGE2）、MMP1和MMP3等炎症介质的水平。采用Griess试剂法测定上清液中亚硝酸盐含量，以反映NO的生成。

铁死亡检测     通过测定GPX4的表达水平，以及MDA、GSH的水平和铁离子浓度来评估铁死亡。GPX4的表达采用蛋白质印迹法分析。MDA、GSH及铁离子的浓度使用商品化试剂盒按照说明书进行测定。

Nrf2基因敲低及抑制剂实验     Nrf2抑制剂实验：软骨细胞接种于六孔板，待细胞融合至70%~80%时，加入Nrf2抑制剂10μmol/LML385预处理2h，随后更换含10ng/mLIL⁃1β的新鲜培养基，并同时暴露于PEMF（75Hz，1.5mT）处理24h。Nrf2基因敲低实验：将软骨细胞接种于六孔板，使用转染试剂共转染靶向Nrf2的siRNA或对照siRNA。转染24h后，细胞暴露于PEMF（75Hz，1.5mT）并用10ng/mLIL⁃1β刺激24h。处理结束后，分别收集细胞上清液及蛋白样本，测定MMP、PGE2及NO生成水平，并采用蛋白质印迹法检测Nrf2及下游靶蛋白表达以验证抑制效率。

体内实验     本研究经武汉大学伦理委员会批准［WDRM（福）第20240302D号］。18只雄性SD大鼠（18周龄，体重280~320g）购自武汉大学，饲养于温度23℃、湿度50%的环境中。大鼠随机分为三组，每组6只。假手术组（Sham组）：仅切开右侧膝关节皮肤及关节囊，暴露关节腔后逐层缝合，不损伤半月板及韧带；OA模型组（OA组）：采用内侧半月板失稳（DMM）法建立OA模型，手术过程包括剃毛并消毒膝关节区域，作髌旁内侧切口暴露关节腔，钝性分离髌下脂肪垫，切断内侧半月板胫骨韧带使其失稳，逐层缝合关节囊及皮肤，术中行抽屉试验验证造模成功；PEMF处理组（PEMF组）：DMM造模后第3天开始给予PEMF干预，将大鼠置于PEMF发生装置（75Hz，1.5mT）中，每日暴露4h，连续处理8周。实验终点时，过量麻醉处死大鼠，取右侧膝关节软骨组织用于后续组织学及蛋白表达分析。

番红O-固绿染色      过量麻醉处死大鼠后，离断大鼠股骨远端及胫骨近端，剔除周围软组织及滑膜，保留完整关节软骨及软骨下骨。取股骨内侧髁及胫骨平台标本，软骨组织于多聚甲醛中固定24h。样本在30%甲酸福尔马林溶液中脱钙一周，随后流水冲洗30min，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。制备5μm厚切片，进行番红O-固绿染色。

蛋白质印迹分析     收集软骨细胞及大鼠OA模型的软骨组织，用磷酸盐缓冲液洗涤后，使用含1%蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合液的RIPA裂解缓冲液裂解以提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样本经SD⁃SPAGE电泳分离后转印至PVDF膜，室温下用5%牛血清白蛋白封闭1h。膜分别与以下一抗（稀释比例均为1∶500）4℃孵育过夜：抗GPX4、抗Nrf2、抗血红素加氧酶1（HO⁃1）、抗核因子κBp65（NF⁃κBp65）、抗磷酸化NF⁃κBp65（pNF⁃κBp65）、抗磷酸化IκBα（pIκBα）、抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、抗环氧合酶2（COX2）、抗MMP1、抗MMP3、抗铁蛋白（Ferritin）及内参抗β肌动蛋白（β⁃actin）。次日TBST洗涤后，加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10000）室温孵育1h，使用增强型ECL试剂显影。采用Image⁃ProPlus6.0软件（MediaCybernetics公司，美国）分析各蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参β肌动蛋白的灰度比值表示蛋白相对表达水平。

统计学分析     取3次独立重复实验数据，使用SPSS20.0（IBM公司，美国）进行数据分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。统计学显著性定义为P＜0.05。

结果

PEMF对软骨细胞活力的影响      采用CCK⁃8法评估了PEMF对软骨细胞活力的影响。单独暴露于PEMF对软骨细胞活性无显著影响（图1），表明该磁场强度适用于进一步研究。同时，IL⁃1β处理显著降低了软骨细胞活性。然而，研究发现PEMF能有效拮抗此种活性降低，提升被IL⁃1β抑制的软骨细胞活性（图1）。

PEMF减轻IL⁃1β诱导的炎症反应及MMP生成      在OA的病程发展中，炎症反应与MMP是关键因素。为评估PEMF在OA中的潜在保护作用，本研究检测了PGE2、MMP1、MMP3及NO的水平。如图2所示，用IL⁃1β刺激软骨细胞导致PGE2、MMP1、MMP3和NO的生成显著升高。然而，PEMF处理显著降低了IL⁃1β刺激的软骨细胞中这些炎症介质和MMP的生成（图2）。这些结果表明，PEMF能够抑制由IL⁃1β引发的炎症反应和MMP活性。

PEMF减轻IL⁃1β诱导的软骨细胞铁死亡      铁死亡已被确定为OA进展的关键因素，抑制铁死亡可有效延缓疾病进程。因此，本研究探讨了PEMF对软骨细胞铁死亡的影响。如图3所示，使用IL⁃1β刺激软骨细胞导致MDA和铁离子水平显著升高。相反，PEMF处理显著降低了IL⁃1β刺激的软骨细胞中MDA和铁离子的生成（图3）。此外，在IL⁃1β处理的软骨细胞中，GPX4、铁蛋白及GSH的表达明显降低。然而，PEMF显著上调了这些细胞中GPX4、铁蛋白和GSH的表达（图3）。综上所述，这些发现表明PEMF能有效抑制IL⁃1β诱导的软骨细胞铁死亡。

PEMF对IL⁃1β诱导的NF⁃κB活化的影响      NF⁃κB是一种关键的转录因子，负责调控多种促炎基因的表达。本研究采用蛋白质印迹法检测NF⁃κBp65总蛋白、pNF⁃κBp65及pIκBα的表达水平，以评估NF⁃κB通路的活化状态。如图4所示，与对照组比较，IL⁃1β刺激导致软骨细胞中pNF⁃κBp65及pIκBα的蛋白表达显著上调（P＜0.05）；而PEMF处理可显著抑制IL⁃1β诱导的pNF⁃κBp65及pIκBα表达升高（P＜0.05）。NF⁃κBp65总蛋白在各组间表达水平无明显变化。上述结果表明，PEMF能够有效抑制IL⁃1β诱导的NF⁃κB通路活化。

PEMF通过激活Nrf2调节炎症与铁死亡     Nrf2是协调细胞氧化应激反应的关键转录调节因子。其激活已被证明可减轻炎症和铁死亡。因此，本研究探讨了PEMF对Nrf2表达的影响。如图5所示，用IL⁃1β刺激软骨细胞导致Nrf2及其下游靶点HO⁃1的表达水平升高。值得注意的是，PEMF处理进一步显著上调了IL⁃1β刺激的软骨细胞中Nrf2和HO⁃1的表达（图5）。此外，使用ML385药物抑制Nrf2或基因敲减Nrf2均能有效逆转PEMF在IL⁃1β刺激的软骨细胞中的抗炎和铁死亡抑制作用（图6、7）。综上所述，这些发现表明PEMF通过激活Nrf2通路发挥其抗炎和抑制铁死亡的作用。

PEMF可缓解DMM大鼠模型的OA进展      在大鼠体内实验中，OA组与Sham组比较，OA组的表层软骨结构呈现出明显的退变。其特征表现为显著的软骨纤维化、软骨厚度变薄、以及延伸至肥大软骨层的裂隙，导致关节软骨整体形态不规则。比较之下，PEMF处理显著增加了软骨厚度并减少了纤维软骨的形成。PEMF处理组表层软骨细胞排列整齐且结构维持良好（图8）。重要的是，体内实验结果与体外实验结果相一致（图8）。本研究同时通过Westernblot技术检测了PEMF对OA模型中相关蛋白表达的影响，结果证实PEMF具有显著的抗炎及抗铁死亡作用。实验数据显示，与Sham组比较，OA组中促炎介质iNOS、COX⁃2及MMP1、MMP3的蛋白表达水平均显著升高；而经PEMF干预后，上述因子的表达均被显著抑制，表明PEMF能有效缓解OA进程中的炎症反应。同时，对铁死亡相关标志物的检测发现，OA组中GPX4和Ferritin的表达水平较Sham组显著降低，而PEMF治疗能够明显回调这两种蛋白的表达，提示其可能通过改善细胞的抗氧化能力及铁代谢稳态来发挥保护作用。结合定量分析的趋势来看，PEMF虽未能将所有指标完全恢复至Sham组水平，但其对上述关键蛋白的调控作用在统计学上均具有显著性。综上，该部分Westernblot结果从分子层面证实，PEMF可能通过抑制炎症通路iNOS/COX⁃2/MMPs及调节铁死亡相关蛋白GPX4/Ferritin的表达，从而在OA中发挥潜在的治疗作用（图8）。

讨论

目前，药物治疗是OA的主要干预手段。一线药物包括非甾体抗炎药、对乙酰氨基酚、镇痛药及糖皮质激素，在症状控制方面显示出显著疗效。然而，长期使用非甾体抗炎药与环氧化酶-2抑制剂可能导致潜在的胃肠道损伤，且无法延缓OA的进展。因此，探寻更有效、更安全的OA治疗方法已成为开发替代性预防和治疗策略的关键焦点。本研究结果表明，PEMF通过抑制软骨细胞的炎症和铁死亡，对OA产生治疗作用。OA的发病机制目前尚未完全阐明，现有治疗主要集中于症状缓解。传统观点认为，OA是一种退行性疾病，其特征是关节软骨降解、软骨下骨硬化及骨赘形成。然而，随着研究的深入，炎症反应在OA发展中的关键作用日益凸显。在OA进展过程中，免疫细胞释放促炎细胞因子和介质，如肿瘤坏死因子-α、IL⁃1β、白细胞介素-6及MMP（包括MMP1、3、13等），进而触发并放大免疫反应。实验证据一致表明，减轻炎症过程可有效延缓OA的进展。在本研究中，我们使用IL⁃1β作为炎症介质来模拟OA的病理特征。NF⁃κB信号通路在OA发病中发挥关键作用，调控软骨细胞的增殖、凋亡、分化及炎症反应。肿瘤坏死因子-α等炎症因子通过与相应受体结合激活NF⁃κB通路，导致p65及IκB的表达与磷酸化。这种磷酸化进一步促进COX⁃2、白细胞介素-6及MMP等炎症因子的过表达，加速关节软骨降解，从而推动OA的发展。因此，抑制NF⁃κB的活化可缓解OA的进展。我们的研究表明，PEMF显著抑制了IL⁃1β诱导的炎症介质、MMP、p65及IκB的产生，证明PEMF可通过抑制炎症反应及NF⁃κB信号通路来延缓OA进展。

铁死亡是一种由致死性脂质过氧化驱动的铁依赖性程序性细胞死亡，可通过阻断脂质过氧化或消耗铁离子予以抑制。近期研究表明，抑制铁死亡可促进OA的治疗，这使铁死亡成为OA的潜在治疗靶点。GPX4是铁死亡的主要调控因子。GSH由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成，是细胞抗氧化防御体系的重要组成部分。GSH被GPX4利用以降解脂质过氧化物，在防止铁死亡中发挥关键作用。铁死亡的实质在于GSH水平下降、GPX4活性减弱，以及无法通过GPX4催化的GSH还原途径代谢脂质过氧化物。Nrf2是细胞氧化应激反应的主要转录因子，与转录激活及铁死亡密切相关。在OA的发展中，软骨细胞铁死亡起着关键作用，而激活Nrf2可抑制软骨细胞铁死亡，从而延缓OA进展。本研究发现，PEMF显著提高了Nrf2及HO⁃1的表达。Nrf2抑制剂及其基因敲低逆转了PEMF对IL⁃1β诱导的OA及铁死亡的抑制作用，表明PEMF通过激活Nrf2信号通路对OA发挥保护作用。

铁死亡与炎症反应之间存在复杂的双向调控关系，二者在多种疾病病理进程中相互交织、协同作用。一方面，铁死亡可通过释放损伤相关分子模式激活模式识别受体及NOD样受体蛋白3炎症小体，促进促炎因子释放，并导致调节性T细胞免疫功能受损，从而直接触发或加剧炎症反应；另一方面，炎症介质及多条信号通路可通过干扰铁代谢、脂质过氧化及抗氧化防御系统调控铁死亡进程。二者共享核心分子机制，其中Nrf2⁃GPX4轴是关键的调控枢纽，而脂质过氧化与氧化应激相互强化，形成“铁死亡-氧化应激-炎症”恶性循环，铁代谢与GSH耗竭等环节亦紧密关联。在OA、急性肺损伤、心血管疾病及感染等多种疾病模型中，铁死亡与炎症的协同作用已被证实，靶向这一交互网络有望为相关疾病的治疗提供新的策略。

细胞如何感知物理刺激（如PEMF）并将其转导为生化信号的机制相对复杂。整合素作为机械感受器之一，能够将机械应变转化为生化信号。这一过程包括与细胞外基质配体结合并激活参与机械诱导细胞分化的特定信号通路。整合素可能在PEMF介导的软骨细胞铁死亡抑制中作为敏感受体发挥作用。既往研究表明，整合素可调节Nrf2的水平，而这对白细胞介素-1α依赖性COX⁃2的诱导至关重要。近期新研究发现，COX⁃2可利用比COX⁃1更广泛的底物。除了标准的花生四烯酸外，COX⁃2还能将二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸转化为前列腺素衍生物。这些前列腺素衍生物可进一步转化为具有抗炎和抗氧化特性的亲电羰基衍生物分子，这些分子能使转录因子Nrf2与Kelch样ECH关联蛋白1解离，随后激活多种含有抗氧化反应元件的抗氧化相关基因，如HO⁃1及GSH。这或许可以解释本研究中PEMF显著提高Nrf2及HO⁃1表达的实验结果。本研究结果表明，PEMF在体内外均通过抑制炎症和铁死亡来缓解OA发展。然而，PEMF干预软骨细胞铁死亡的具体机制尚未在本研究中得到深入探索。未来的研究应聚焦于此，以期更全面地理解OA的发病机制。综上所述，PEMF可通过激活Nrf2信号通路，抑制IL⁃1β诱导的炎症及铁死亡，从而缓解大鼠OA的发展。PEMF是一种具有前景的OA治疗方法。

来源：骨科2026年5月第17卷第3期